从Wnt/β-catenin信号通路研究地黄饮子汤剂对去卵巢骨质疏松模型大鼠的防治作用*

席永斌，颜春鲁，孙仕华，蔡成成，王经韬

(1. 兰州市第二人民医院，甘肃 兰州 730046； 2.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000)

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种主要累及中老年人群的全身骨代谢障碍的疾病，主要特征是骨量减少、结构退化、骨脆性增加，致残率和死亡风险极高[1-2]，给社会和家庭带来沉重的经济负担。本课题组前期研究[3]发现，地黄饮子水煎剂能显著提高绝经后骨质疏松大鼠的骨密度OPG含量，显著降低绝经后骨质疏松大鼠RANK和RANKL含量，从而通过促进骨形成、抑制骨吸收来调节骨代谢。为了进一步明确地黄饮子的治疗机制，本研究通过观察去卵巢骨质疏松模型大鼠的股骨病理形态改变及股骨组织中Wnt、Wnt1、β-catenin、LRP5蛋白表达水平的变化，从而初步揭示补肾中药地黄饮子防治骨质疏松症的作用机制，为临床治疗骨质疏松症提供理论基础和治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 动 物

健康雌性SPF级SD大鼠60只，平均体质量(180±20)g，由甘肃中医药大学科研实验动物饲养中心提供，动物质量合格证号：SCXK(甘)2011-0001。

1.2 药品、试剂与仪器

地黄饮子处方组成：熟干地黄12 g，巴戟天15 g，山萸肉15 g，石斛15 g，肉苁蓉15 g，附子15 g，五味子15 g，肉桂15 g，白茯苓15 g，麦冬15 g，石菖蒲15 g，远志15 g。药材均购自甘肃中医药大学附属医院。剂量换算方法参考《中药药理实验方法学》，地黄饮子人常用剂量是177 g/d，换算成标准体质量大鼠的剂量为 177×0.018=3.186 g/只。按照大鼠的标准体质量为200 g，则大鼠的剂量为3.186 g×5≈16 g/kg。依此剂量为大鼠的中剂量，则地黄饮子高、中、低剂量分别为32，16，8 g/kg。常规水煎，制成含生药 1.593 g/mL的药液。水合氯醛，购自天津市光复精细化工研究所，批号20150105；戊酸雌二醇片，1 mg/片，购自拜耳医药保健有限公司广州分公司，批号156A；青霉素，160万U/瓶，购自华北制药股份有限公司，批号F6042103；GAPDH抗体，购自Immuno Way公司，批号B4501； Wnt1和LRP5抗体均购自Abcam，批号依次为GR288344-1，GR274173-1；Wnt和β-catenin抗体购自GeneTex，批号依次为42536，47854。BioMATE 3S型蛋白、核酸浓度测定仪，Thermo公司产品；ChemiDocTMXRS+型凝胶成像分析系统，美国Bio-Rad公司产品；BX53型显微镜，日本OLYMPUS公司产品；ZY12306型微量加样器，ScienTiFic产品；OSE-Y10型电动组织研磨器，上海Tiangen 公司产品。

1.3 动物分组、模型的建立与给药

将大鼠随机分为假手术组，模型对照组，戊酸雌二醇组，地黄饮子汤剂高、中、低剂量组，每组10只。用质量分数为40 g/L 的水合氯醛(3 μg/g)腹腔注射麻醉大鼠，俯卧位姿势固定于自制的鼠架上，从腰背部脊柱两侧作纵行切口切开皮肤和肌肉，摘除两侧卵巢组织后逐层缝合，关闭创口[4]。假手术组大鼠只切除卵巢附近脂肪组织。术后使用青霉素防感染，使用电暖器保温。造模成功后12周给予药物治疗。地黄饮子汤剂高、中、低剂量组依次给予地黄饮子汤剂32，16，8 g/kg体质量，戊酸雌二醇组给予戊酸雌二醇片0.09 μg/g体质量，假手术组和模型对照组大鼠给予等体积蒸馏水，均灌胃给药，1 d 1次，连续4周。

1.4 检测指标

末次给药24 h后，用电子天平称量各组大鼠体质量，麻醉后股动脉采血，处死各组动物，摘取子宫并称量质量，摘取左侧股骨做HE染色，摘取右侧股骨做Wnt、Wnt1、β-catenin和LRP5蛋白表达的测定。

1.4.1 子宫指数

子宫指数(mg/g)=子宫质量(mg)/大鼠体质量(g)

1.4.2 股骨组织病理形态改变

将以40 g/L 多聚甲醛固定液浸泡的左侧股骨送往兰州大学病理实验室，脱钙处理 1周后制作石蜡切片，切片厚度5 μm， HE染色后请甘肃中医药大学基础医学院病理教研室的老师进行阅片。HE染色的具体方法参照文献[5]进行，光镜下观察各组大鼠骨组织的病理形态变化。

1.4.3 股骨组织Wnt、Wnt1、β-catenin、LRP5蛋白表达

以RIPA裂解液提取右侧股骨总蛋白，BCA法测定蛋白含量，生理盐水调整各检测样品的蛋白质量浓度为5 g/ L，加入4×上样缓冲液，沸水浴5 min后取10 μL 样品进行 SDS-PAGE 凝胶电泳并进行转膜、封闭、一抗Wnt、Wnt1、β-catenin和LRP5的孵育、TBST洗涤、二抗孵育，最后进行显色、曝光、显影、定影，并观察其蛋白表达变化。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 各组大鼠子宫指数对比

与假手术组对比，模型对照组大鼠子宫指数降低，差别有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组对比，地黄饮子中、高剂量组和戊酸雌二醇组大鼠子宫指数升高，差别有统计学意义(P<0. 05)。见表 1。

组 别子宫指数/ (mg·g-1)假手术组1.87±0.15模型对照组0.67±0.11∗戊酸雌二醇组1.12±0.07#地黄饮子汤剂高剂量组1.35±0.09#地黄饮子汤剂中剂量组1.07±0.24#地黄饮子汤剂低剂量组0.78±0.16

注：与假手术组对比，*P<0.05；与模型对照组对比，#P<0.05

2.2 各组大鼠股骨组织病理形态改变对比

光镜下显示：假手术组大鼠的骨小梁基本结构未见明显异常，骨小梁排列有序、网状结构清晰可见。模型对照组大鼠的骨小梁基本结构出现明显病理学改变，表现为骨小梁结构不完整、断裂和网状结构消失现象。地黄饮子汤剂低、中剂量组骨小梁结构有断裂现象。地黄饮子汤剂高剂量组和戊酸雌二醇组骨小梁病理变化较模型对照组明显改善，骨小梁结构接近正常，排列比较规则有序。见图 1。

1. 假手术组； 2.模型对照组； 3.戊酸雌二醇组；4. 地黄饮子汤剂高剂量组；5. 地黄饮子汤剂中剂量组；6. 地黄饮子汤剂低剂量组图 1 各组大鼠股骨组织病理形态变化(HE，20×)

2.3 各组大鼠股骨组织Wnt、Wnt1、β-catenin、LRP5蛋白表达对比

与假手术组对比，模型对照组大鼠股骨组织Wnt、Wnt1、β-catenin、LRP5蛋白表达升高，差别有统计学意义(P<0. 05)。与模型对照组对比，地黄饮子汤剂各剂量组和戊酸雌二醇组股骨组织Wnt、Wnt1、β-catenin、LRP5蛋白表达降低，差别有统计学意义(P<0. 05)。见表2和图2。

组 别WntWnt1β-cateninLRP5假手术组0.47±0.070.63±0.050.82±0.140.75±0.04模型对照组0.98±0.04∗1.17±0.07∗2.34±0.11∗1.83±0.09∗戊酸雌二醇组0.51±0.02#0.68±0.13#1.15±0.11#0.81±0.03#地黄饮子汤剂高剂量组0.58±0.11#0.71±0.09#1.42±0.05#0.89±0.12#地黄饮子汤剂中剂量组0.62±0.04#0.75±0.02#1.52±0.13#0.95±0.05#地黄饮子汤剂低剂量组0.73±0.05#0.87±0.02#1.65±0.10#1.12±0.15#

注：与假手术组对比， *P<0.05；与模型对照组对比，# P<0.05

1.假手术组；2.模型对照组；3.戊酸雌二醇组；4.地黄饮子汤剂高剂量组； 5.地黄饮子汤剂中剂量组； 6.地黄饮子水煎剂低剂量组图 2 各组大鼠股骨组织Wnt、Wnt1、β-catenin、LRP5蛋白的表达

3 讨 论

骨质疏松症属于中医学“骨枯”“骨萎”等范畴。肾精亏虚致骨枯髓减是骨质疏松的主要病机，故防治骨质疏松症的关键在于补肾[6-7]。补肾中药地黄饮子方中熟地黄、山萸肉滋补肾阴; 巴戟天、肉苁蓉温补肾阳；麦冬、石斛、五味子以助滋阴敛液；附子、肉桂以助温养真元，摄纳浮阳，引火归原；菖蒲、远志、茯苓交通心肾，宣窍化痰。诸药合用，共奏滋阴助阳补肾、填精益髓之效。研究发现地黄饮子中的部分药物对骨质疏松具有治疗作用[8-9]，但是诸药合用对抗骨质疏松的作用机制尚未做研究。

目前，关于骨质疏松症的病机研究主要集中于信号通路，如Wnt/β-catenin信号通路和ERK1/2信号通路等[10]。Wnt、β-catenin、LRP4-6等蛋白是调控Wnt/β-catenin信号通路的关键因子[11]。Wnt与相关受体结合后在提高细胞液β-catenin含量的同时，可以促使β-catenin转位进入细胞核，与核内的TCF/LEF结合形成核复合物后激活下游基因的转录，进而激活Wnt/β-catenin信号通路[12]。研究发现，去卵巢模型鼠可激活Wnt/β-catenin信号通路[13]。Wnt1 的表达强度可以反映成骨细胞的骨形成活性，β-catenin和LRP5是调控成骨细胞骨量的关键因子[14-15]。因此，Wnt1、β-catenin和LRP5可能是治疗骨质疏松症的潜在有效靶点。在本研究中，HE染色结果显示：模型对照组大鼠有骨小梁结构不完整、断裂和网状结构消失现象。说明大鼠去卵巢后，成骨细胞活性和骨形成均受到抑制，引发骨量减少，破坏骨组织形态。使用地黄饮子干预后，高剂量组骨形成明显活跃，骨组织形态获得显著改善，骨量丢失得到抑制。同时，Western-Blot结果显示：模型对照组大鼠股骨组织Wnt、Wnt1、β-catenin、LRP5蛋白表达较假手术组明显升高，给予地黄饮子汤剂干预后，地黄饮子汤剂各剂量组股骨组织Wnt、Wnt1、β-catenin、LRP5蛋白表达降低。说明地黄饮子通过调控Wnt/β-catenin信号通路的上述蛋白表达来影响成骨细胞的形成、分化，抑制骨破坏，降低骨转化率，维持骨形成和骨吸收的动态平衡，从而减少骨量丢失，进而改善骨组织形态，提高骨密度，发挥对去卵巢骨质疏松模型鼠骨量减少及骨质疏松形成的防治作用。