竹䇲鱼微卫星标记开发及跨物种扩增

梁镇邦，吴仁协，牛素芳，罗惠桂



竹䇲鱼微卫星标记开发及跨物种扩增

梁镇邦，吴仁协，牛素芳，罗惠桂

（广东海洋大学水产学院，广东 湛江 524088）

【目的】筛选高多态性竹䇲鱼（）微卫星（SSR）标记，并验证其在鲹科鱼类中的通用性。【方法】采用SLAF-seq技术识别竹䇲鱼基因组SSR标记，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳筛选高多态性位点，并进行跨物种PCR扩增。【结果与结论】识别出43 264个二至六碱基重复SSR标记，二、三碱基重复SSR标记较多（90.33%）。筛选出37个多态性的二、三碱基SSR位点，各位点的等位基因数为4 ~ 26，期望杂合度为0.481 ~ 0.935，多态信息含量为0.440 ~ 0.934。有30个位点符合哈迪-温伯格平衡，且各位点间不存在连锁不平衡现象。共有28个竹䇲鱼SSR标记可在1种以上鲹科鱼类中有效扩增，分别有24、21、20、19和11个SSR位点可在蓝圆鲹（）、长身圆鲹（）、无斑圆鲹（）、颌圆鲹（）及金带细鲹（）中稳定扩增，可为竹䇲鱼遗传资源评估和部分鲹科鱼类的系统进化分析提供重要遗传物质基础及有力的分析手段。

竹䇲鱼；微卫星标记；跨物种扩增；SLAF-Seq技术

竹䇲鱼（）隶属鲈形目（Perciformes）鲹科（Carangidae）竹䇲鱼属(），广泛分布于西北太平洋，为暖水性中上层重要经济鱼类[1]。21世纪初，中国竹䇲鱼的年均捕捞量约为3.4万t，2008年捕捞量达最高峰，约为5.9万t[2]。随着底层、高营养级鱼类资源的衰退，竹䇲鱼的捕捞压力逐渐增加，已出现小型化、生长加快等生物学特征退化现象[3-5]。目前，有关竹䇲鱼的研究主要集中在渔业资源、摄食习惯、生物学特征及食品加工等方面[6-10]，而关于其分子标记和种质资源遗传背景调查的研究报道较少。在种质资源遗传学研究方面，Song等[11]利用线粒体控制区研究表明，日本沿海、中国福建和北部湾的竹䇲鱼群体可能是单一的随机交配群体；Zhao等[12]基于AFLP分析认为，竹䇲鱼日本沿海和中国北部湾群体间无明显的遗传分化。在微卫星标记方面，仅Dae等[13]采用富集文库法开发出10个二碱基重复序列的竹䇲鱼微卫星位点。竹䇲鱼种群遗传资源研究需要大量高多态性、类型多样化的微卫星标记，而已开发的10个微卫星位点远不能满足需求。因此，急需开发更多类型丰富的多态性微卫星位点。

微卫星DNA亦称为简单重复序列（Simple sequence repeat，SSR），在真核生物基因组中分布广泛（每隔10 ~ 50 kb即有1个SSR），其侧翼序列较为保守，而核心序列存在高度变异[14]，现已广泛应用于海洋生物的种质资源评估、遗传图谱构建和系统进化等研究[15-18]。目前，有多种SSR标记开发方法。随着测序技术的快速发展，高通量测序技术逐渐取代基因组文库筛选法、富集文库法等传统SSR开发方法。基于高通量测序平台的特异性扩增片段测序（Specific-Locus Amplified Fragment Sequencing，SLAF-seq）技术成本低、周期短、测序深度高，是一种性价比高、适用范围广的SSR开发方法[19-20]，已成功用于带鱼（）[21]、沙带鱼（）[22]和蓝圆鲹（）[23-24]等多种海洋鱼类的SSR标记开发。

本研究采用SLAF-seq技术识别竹䇲鱼基因组DNA中的SSR位点，以开发出多态性高、类型丰富的SSR标记，并检测其开发的标记在蓝圆鲹、长身圆鲹（）、无斑圆鲹（）、颌圆鲹（）及金带细鲹（）等鲹科鱼类中的通用性。研究结果可为竹䇲鱼群体遗传学研究和种质资源评估提供多样化和高分辨力的分子标记，也可为相关鲹科鱼类的系统进化研究提供新的分析手段。

1 材料与方法

1.1 样品与DNA提取

竹䇲鱼（32尾）于2015年4月采自广东江门上川岛，无斑圆鲹（2尾，三亚）、长身圆鲹（8尾，文昌和三亚）、颌圆鲹（1尾，南沙）、蓝圆鲹（6尾，汕头和广东雷州珍稀海洋生物国家级自然保护区）和金带细鲹（3尾，广东雷州珍稀海洋生物国家级自然保护区）系2014―2016年春季采集于南海北部各渔港。取其背部肌肉，置于体积分数95%酒精中，于-20 ℃下保存备用。参照《分子克隆实验指南》[25]，采用传统酚-氯仿法提取样品基因组DNA。

1.2 SLAF-seq测序

将1个竹䇲鱼肌肉样品送至北京百迈客生物科技有限公司，采用SLAF-seq技术进行SSR标记开发，参照Sun等[19]和Niu等[24]的方法构建基因组文库、评估测序质量和识别微卫星位点等。从较为丰富的二、三碱基重复SSR标记中随机挑选出200个重复次数为7 ~ 20、侧翼序列较长的SSR位点，利用Primer 3.0设计各位点引物，所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 SSR引物多态性

随机选取6尾竹䇲鱼的基因组DNA作为模板，对200对SSR引物进行多态性筛选。PCR体系包括：1.5 μL 10×PCR Buffer，0.5 μL dNTP（10 mmol/L），1 μL正反引物（10 μmol/L），1 μL DNA模板（10 ~ 50 ng）和1.5 μLDNA聚合酶。反应条件：95 ℃5 min；95 ℃30 s，62 ~ 52 ℃30 s（每循环降1 ℃），72 ℃30 s，共25个循环；最后72 ℃下延伸10 min。PCR产物通过聚丙烯凝胶电泳统计样品扩增成功率和条带数，选择出现3条或以上特异性条带的位点。

1.4 多态性引物PCR和分型检测

参考Schuelke[26]的三引物法进行多态性引物PCR。在多态性SSR位点的正向引物5′ 端添加M13序列（5′-AGGGTTTTCCCAGTCACG-3′或5′-GAG CGGATAACAATTTCACAC-3′），合成M13标记引物，同时合成相同序列的M13通用引物（用FAM或HEX荧光基团修饰其5′ 端）。通过梯度PCR（52 ~ 62℃）摸索M13标记引物的最适退火温度，利用最适退火温度对32个竹䇲鱼样品进行扩增。PCR体系：2 μL 10×PCR Buffer，0.5 μL dNTP（10 mmol/L），0.1 μL M13标记引物（10 μmol/L），0.6 μL反向引物（10 μmol/L），0.6 μL M13通用引物（10 mmol/L），1 μL DNA模板（10 ~ 50 ng）及1.5 μLDNA聚合酶。PCR反应条件：95 ℃5 min；95 ℃30 s，（52 ~ 62 ℃）30 s，72 ℃30 s，共26个循环；最后72 ℃下延伸10 min。PCR产物送至天一辉远生物科技有限公司进行毛细管电泳分型检测。

1.5 跨物种通用性检测

将筛选出的多态性竹䇲鱼SSR引物对颌圆鲹（= 1）、长体圆鲹（= 8）、无斑圆鲹（= 2）、金带细鲹（= 4）、蓝圆鲹（= 6）等5种鲹科鱼类进行通用性检测。PCR体系和扩增程序同1.4，采用聚丙烯凝胶电泳检测PCR产物。胶图中有1条以上等位基因条带的位点视为通用位点。

1.6 数据分析

通过Micro-Checker v.2.2.3[27]检测等位基因数据的准确性，确认无误后，进行无效等位基因频率（ua）评估及后续的数据分析。利用GenAlEx 6.503软件[28]计算各位点的等位基因数（a）、有效等位基因数（e）、表观杂合度（o）和期望杂合度（e），采用Cervus 3.0.7[29]软件计算多态信息含量（PIC），使用GenePop 4.3[30]计算Hardy-weinberg平衡（HWE）、近交系数（is）以及连锁不平衡检测。

2 结果与分析

2.1 高通量测序结果

SLAF测序产生6.11×106原始数据（reads），其中GC含量为43.09%，符合测序质量要求（碱基质量值> 30）的碱基占80.86%。经识别和过滤，共获得3.16×106个SLAF标签，测序深度为13.26×。MISA软件共识别出43 264个SSR位点，其中二碱基重复SSR（Di-nucleotide）29 457个（68.09%），三碱基重复SSR（Tri-nucleotide）9 623个（22.24%），四碱基重复SSR（Tetra-nucleotide）2 939个（6.79%），五碱基重复SSR（Penta-nucleotide）956个（2.21%），六碱基重复SSR（Hexa-nucleotide）289个（0.67%）。

2.2 多态性SSR位点筛选

基于6个竹䇲鱼基因组DNA，从200个二、三碱基重复SSR位点中初步筛选多态性位点。结果显示，26个位点无扩增条带，71个位点扩增出1条特异性条带，53个位点扩增出2条特异性条带，分别有20、22、4、4个位点扩增出3、4、5、6条特异性条带。

最后挑选出50个可扩增出3条或以上特异性条带的SSR标记合成M13标记引物，并在32尾竹䇲鱼中进行PCR扩增，最终36个多态性SSR位点能在27 ~ 32个竹䇲鱼样品中稳定地扩增出特异性条带，1个位点（TJ2-20）仅在19个样品中扩增出特异性条带。37个SSR位点的GenBank登录号为MK357853―MK357889（表1、2）。

2.3 竹䇲鱼SSR标记多态性分析

各位点的遗传多样性数据如表2所示。37个SSR位点在32个竹䇲鱼样品中共检测到508个等位基因，平均等位基因数为13.73，其中TJ2-39位点的等位基因数最少（a= 4），TJ2-24位点的等位基因数最多（a= 26）；有效等位基因数为2.002 ~ 15.929，平均6.90。16个位点的等位基因数与有效等位基因数之间的差值小于6，说明这些SSR位点的等位基因在被测群体基因组中的分布比较均匀。期望杂合度为0.481 ~ 0.935，平均值为0.807；观测杂合度为0.508 ~ 0.955，平均值为0.739。多态信息含量为0.440 ~ 0.934，平均值为0.771。经Bonferroni校正后，TJ2-10、TJ2-11、TJ2-17、TJ2-23、TJ2-36和TJ2-44位点偏离哈迪-温伯格平衡（< 0.001 4），这6个位点均具有较高的无效等位基因频率（ua= 0.049 8 ~ 0.189 2）和近交系数（is= 0.131 0 ~ 0.433 4），其他31个位点间不存在连锁不平衡现象。

表1 37个竹䇲鱼SSR标记信息

表2 37个竹䇲鱼SSR位点的群体遗传学特征

注：a：退火温度；：样品数；*：经Bonferroni校正后显著偏离哈迪-温伯格平衡(= 0.05,< 0.001 4)

2.4 跨物种扩增

37个竹䇲鱼SSR位点的跨物种扩增结果如表3所示。有28个SSR位点可在1种以上鲹科鱼类中进行有效扩增（占已开发位点的75.68%），其中6个位点可在5种鲹科鱼类中扩增，7个位点可在4种鲹科鱼类中扩增，5个位点可在3种鲹科鱼类中扩增，5个位点可在2种鲹科鱼类中扩增，5个位点可在1种鲹科鱼类中扩增。其中，竹䇲鱼SSR位点在蓝圆鲹和长身圆鲹中的通用性较佳，扩增成功率分别为64.86%和56.76%；在无斑圆鲹和颌圆鲹中的通用性次之，扩增成功率分别为54.05%和51.35%；而在金带细鲹中的通用性较差，扩增成功率为29.73%。可见，竹䇲鱼SSR位点的侧翼序列在部分鲹科鱼类中有一定保守性。

表3 37个竹䇲鱼SSR位点在5种鲹科鱼类中的跨物种扩增

注:，样品数；+，可扩增；-，不可扩增；AL，可扩增率（%）；括号里为等位基因数

3 讨论

3.1 SLAF-seq技术开发SSR标记

本研究获得的竹䇲鱼基因组测序质量30为80.86%，GC含量为43.09%，表明用SLAF-seq技术获得的基因组数据质量较佳，可用于后续SSR位点开发。在竹䇲鱼基因组中共获得39 080个（90.33%）常见的短碱基重复SSR（二碱基和三碱基），亦检测出4 184个（9.67%）相对稀少的长碱基重复SSR（四至六碱基）。而传统的SSR开发方法获得的SSR类型基本是二碱基或复合二碱基，且数量较少。如Dae等[13]通过磁珠富集文库法仅获得10个竹䇲鱼二碱基重复SSR位点，Cristian等[31]利用磁珠富集文库法开发出8个智利竹䇲鱼（）SSR位点（二碱基4个、复合二碱基1个、三碱基2个、4碱基1个）。可见，本研究利用SLAF技术开发出的SSR数量和类型远超传统的SSR开发方法，表明基于高通量测序的SLAF技术是较为快速、高效的SSR分离方法。

在本研究随机挑选的200个SSR位点中，有174个（87%）位点可扩增出1条以上特异性条带；在可扩增出3条或以上特异性条带的50个位点中，有36个（72%）多态性位点可在27 ~ 32个竹䇲鱼样品中稳定扩增出特异性条带，表明竹䇲鱼SSR开发成功率较高，提示本研究所获得的43 264个SSR位点标记开发潜力可能较高，可为后续筛选出高多态性的SSR标记提供充足的遗传物质来源基础。

3.2 SSR标记的多态性及其遗传学特征

遗传多样性分析可反映群体内遗传变异情况，可作为筛选优良SSR位点判断依据。Barker[32]和Botstein等[33]认为，若SSR标记多于26个，每个标记至少有4个等位基因数，且每个标记多态性信息含量较高（PIC > 0.5），可认为遗传多样性分析结果较为可信且研究群体遗传多样性较丰富。本研究中，各位点平均等位基因数为13.73，平均多态信息含量为0.772，表明广东江门群体遗传变异水平较高。

本研究中，竹䇲鱼SSR位点平均等位基因数、杂合度、多态信息含量高于Cristian等[31]开发的8个智利竹䇲鱼二碱基重复SSR位点(a=10.88，o=0.709，e=0.786)和张浩冉等[22]开发的28个沙带鱼二、三碱基重复SSR位点(a= 9.11，o= 0.634，PIC= 0.670)，但与Dae等[13]开发的10个竹䇲鱼二碱基重复SSR位点(a=14，o=0.695，e=0.805)、Galleguillos等[34]开发的9个智利竹䇲鱼四碱基重复SSR位点（a= 13.75，o= 0.808，e= 0.875）和翟云等[23]开发的31个蓝圆鲹四、五碱基重复SSR位点(a= 13.48，o= 0.650，PIC= 0.803)相当，表明本研究所开发竹䇲鱼SSR标记多态性和分辨力均较高。

经Bonferroni校正后，共有6个SSR位点偏离哈迪-温伯格平衡，可能与有无效等位基因、近亲交配、自然选择及种群退化等相关[35-36]。6个位点近交系数（0.131 ~ 0.433）和无效等位基因频率（0.050 ~ 0.189）均较高，故可认为二因素是造成6个位点偏离哈迪-温伯格平衡的重要原因。其次，竹䇲鱼的捕捞压力日益增大，海洋环境逐渐恶化，可能导致自然选择压力逐渐增大，进而引发竹䇲鱼呈繁殖率上升、寿命缩短、体型变小等种群退化现象[4,37]。因此，自然选择和种群退化也可能是这6个位点偏离哈迪-温伯格平衡的因素。此外，杨君等[38]基于SSR标记分析刺槐叶瘿蚊（）遗传多样性指数与样本量的相关性发现，样本量小于25时，对平均等位基因数、有效等位基因数及观测杂合度均有较明显影响。本研究中，TJ2-20位点的有效扩增个体数为19，可认为该位点遗传多样性参数存在一定偏差。发生变异的SSR位点侧翼序列和有缺陷引物可降低引物与位点侧翼序列的匹配度，可能是TJ2-20位点的有效扩增个体数偏少的重要原因。

综上，本研究开发的37个竹䇲鱼SSR位点有较高的分辨力和多态性水平，其中30个位点符合哈迪-温伯格平衡，可为竹䇲鱼种质资源评估和遗传学研究提供有力工具和技术支撑，而偏离哈迪-温伯格平衡的6个SSR位点和有效扩增个体数少于25的SSR位点需谨慎使用。

3.3 SSR标记的跨物种扩增

Primmer等[39]提出，SSR标记的跨物种扩增成功率与物种间的遗传分化程度呈负相关。基于线粒体COI和Cyt的遗传距离显示，竹䇲鱼与蓝圆鲹、长身圆鲹、无斑圆鲹、颌圆鲹、金带细鲹的遗传距离分别为0.1081、0.1274、0.1282、0.1336、0.1695[24]。而37个竹䇲鱼SSR位点在这五种鲹科鱼类中的跨物种扩增成功率依次为蓝圆鲹64.86%、长身圆鲹56.76%、无斑圆鲹54.05%、颌圆鲹51.35%、金带细鲹29.73%。可见，竹䇲鱼SSR位点在几种鲹科鱼类中的跨物种扩增成功率与种间遗传距离明显呈反比，结果进一步支持了Primmer等[39]的结论。

跨物种扩增可为近缘物种提供SSR位点信息，降低SSR开发成本、减少工作量，且更易于获得高多态性的SSR标记，是SSR标记获取途径中较经济方便的方法之一。本研究中，分别有24、21、20、19、11个竹䇲鱼SSR位点可在蓝圆鲹、长身圆鲹、无斑圆鲹、颌圆鲹及金带细鲹中稳定扩增，这些位点可为5种鲹科鱼类的群体遗传学等相关研究提供直接的标记来源。18个位点可在3 ~ 5种鲹科鱼类中稳定扩增，说明这些位点在部分鲹科鱼类中保守性较高，可为部分鲹科鱼类系统进化研究提供有力的技术支持。

4 结论

基于SLAF-seq技术，共检测到43 264个二至六碱基重复SSR位点，所得SSR开发成功率较高，可为筛选高质量SSR标记及种质资源研究提供重要遗传物质基础。从200个二、三碱基重复SSR标记中成功开发出37个竹䇲鱼SSR位点，其中30个SSR位点遗传信息含量较高，可为竹䇲鱼种质资源评估提供有力的分析手段。28个竹䇲鱼SSR位点在蓝圆鲹、长身圆鲹等鱼类中有通用性，可为5种鲹科鱼类的群体遗传学和系统进化研究等提供新的分子标记。

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Microsatellite Loci Development inby SLAF-seq Technology and Cross-amplification in Five Carangidae Fishes

LIANG Zhen-bang, WU Ren-xie, NIU Su-fang, LUO Hui-gui

（,,524088,）

【Objective】 To develop polymorphic microsatellite markers forand assess their transferability in five Carangidae fishes.【Methods】 The specific-locus amplified fragment sequencing (SLAF-seq) technology was employed to mine the genomic information and isolate microsatellite loci in. Microsatellite polymorphism and cross-amplification were explored by capillary electrophoresis and polyacrylamide gel electrophoresis, respectively.【Result and Conclusion】 SLAF-seq identified 43 264 di- to hexa-nucleotide repeat microsatellites, of which di-nucleotide and tri-nucleotide repeat loci were the most frequent (90.33%).Furthermore, 37 primer pairs of di- and tri-nucleotide repeat loci were successfully designed and exhibited polymorphism. The number of alleles per locus ranged from 4 to 26. The expected heterozygosity and polymorphism information content ranged from 0.481 to 0.935 and from 0.440 to 0.934, respectively.Thirty microsatellite markers were consistent with the Hardy-Weinberg equilibrium and showed no linkage disequilibrium. A total of 28 SSR markers forcould successfully cross-amplify in at least one species of Carangidae.A total of 24, 21, 20, 19, and 11 out of 37 microsatellite loci could cross-amplify in,,,and, respectively. These microsatellite markers could provide a powerful molecular tool for the genetic resource assessment ofand phylogeny study of the related Carangidae species.

; microsatellite loci; cross-species amplification; SLAF-seq

Q78；Q959.483.3

A

1673-9159（2019）04-0005-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2019.04.002

2019-03-03

广东省自然科学基金-博士启动资助项目（2016A030310329）；广东海洋大学优秀青年骨干教师培养计划资助项目（HDYQ2017002）；广东海洋大学科研启动费资助项目（R17040）；广东省科技计划资助项目（2017A030303077）；广东省海洋和渔业发展专项（科技攻关与研发, A201708D07）

梁镇邦（1994—），男，硕士研究生，研究方向为鱼类生物多样性与系统进化。E-mail: liangzhenbang0403@163.com

牛素芳（1987—），女，讲师，博士，研究方向为鱼类种群遗传学和进化基因组学。E-mail: wolf0487@126.com

梁镇邦，吴仁协，牛素芳，等. 竹䇲鱼微卫星标记开发及跨物种扩增[J]. 广东海洋大学学报，2019，39（4）：5-12.

（责任编辑：刘庆颖）