HOXA5、E-cadherin、β-catenin在卵巢癌组织中的表达

黎超莲，邹嘉雯，李荣威，罗伊萍，阳玉中，梁 路，徐龙宽，周英琼

上皮性卵巢癌的发病率在女性生殖系统恶性肿瘤中位居第二位，而死亡率一直高居妇科恶性肿瘤榜首。上皮性卵巢癌的组织学类型多见为浆液性癌、黏液性癌和内膜样癌等，缺乏特异性临床症状和有效的早期诊断手段，大多数患者就诊时已是晚期。目前卵巢癌的主要治疗方法以手术切除联合顺铂化疗为主，然而化疗耐药性严重影响了化疗效果和生存质量，卵巢癌患者的5年生存率仍低于50%[1]。有研究表明，约80%卵巢浆液性肿瘤患者的血清能检测到糖类抗原125(CA125)的提高，但其特异性不高，故临床上不单独用于卵巢癌的早期诊断[2]，临床上将血清人附睾分泌蛋白4(HE4)、CA125、可溶性间皮素相关蛋白(SMRP)这三项标志物进行联合检测有助于卵巢癌的筛查及早期诊断[3-4]。因此，发现特异性的肿瘤标志物应用于临床早期诊断及早期干预具有重要意义。

HOX基因是极其保守的多基因家族，其最先是在探索果蝇胚胎发育的实验中发现的，且大部分存在于真核细胞中；HOX基因在细胞增殖、分化和凋亡中起重要调节作用，其蛋白表达异常，不但会导致个体发育异常、组织器官形态结构改变，而且可导致细胞异常增殖形成肿瘤[5]。 HOXA5是同源异型盒(homologous box gene，HOX)基因家族的成员之一，HOXA5基因在许多肿瘤，尤其是乳腺癌[6]、结肠癌[7]、食管癌[8]中的异常表达均有所报道。β-连环蛋白(β-catenin)与E-钙黏附蛋白(E-cadherin)是Wnt(wingless-type MMTV integration site family members)信号通路中的两个重要成员，β-catenin作为Wnt信号通路的关键调节因子，兼有胞间连接和信号传导的功能；E-cadherin作为重要的细胞连接因子，参与维持细胞的形态和细胞间的连接[9]。

1 材料与方法

1.1 病例资料收集桂林医学院附属医院病理科2009年1月～2014年12月存档的60例卵巢癌病理组织蜡块作为实验组，另取同期卵巢良性肿瘤31例、正常输卵管和卵巢组织31例为对照组。所有患者术前没有经过临床的化学治疗以及生物治疗，且临床及病理资料完整。60例卵巢癌患者年龄17～75(58±14.1)岁，其中<50岁27例，≥50岁33例，根据FIGO卵巢癌组织学分型：浆液性囊腺癌34例，黏液性囊腺癌6例，子宫内膜样癌10例，其他混合型上皮癌或未分化癌共10例；组织学分级：高分化30例，低分化30例。根据FIGO临床分期：Ⅰ～Ⅱ期42例，Ⅲ～Ⅳ 18例。

1.2 实验方法及试剂本实验所纳入的组织标本均使用以下方法处理：① 10%中性福尔马林固定，石蜡包埋；② 4.0 μm连续切片，常规脱蜡至水后，EDTA(pH 8.0)高压修复抗原，PBS冲洗；③ PBS冲洗3次，每次3 min，H2O2浸泡10 min；PBS冲洗3次，每次3 min；滴加羊血清(北京中杉金桥生物技术有限公司，稀释倍数1 ∶10)，置于37 ℃温箱中封闭30 min；④ 滴加一抗，4 ℃过夜；PBS冲洗3次，每次3 min,滴加二抗，室温放置15 min；⑤ PBS冲洗3次，每次3 min，DAB(福州迈新生物技术开发有限公司)显色；⑥ 苏木精复染；⑦ 中性树胶封片。以PBS代替一抗作为阴性对照，以阳性表达的乳腺癌组织为阳性对照。兔源性HOXA5多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，稀释浓度为1 ∶200；兔源性β-catenin多克隆抗体购自武汉博士德生物公司，稀释浓度为1 ∶200；鼠源性E-cadherin抗体购自福州迈新生物技术开发有限公司，稀释浓度为1 ∶200；即用型免疫组化EliVisionTMsuper试剂盒(鼠/兔)和免疫组化一抗稀释液均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3 判断标准HOXA5蛋白主要表达于细胞质。E-cadherin及β-catenin蛋白表达于细胞膜，仅有细胞质及胞核染色为异常情况。HOXA5以细胞质出现棕黄色或黄色颗粒为阳性表达，E-cadherin及β-catenin以细胞膜出现棕黄色或黄色颗粒为阳性表达。每张切片在光镜下随机选取5个视野，每个视野记数100个细胞。① 按阳性着色程度评分：0分为无着色，与背景色一致；1分为稍浅黄色，比背景颜色略深；2分为棕黄色，明显比背景色深；3分为棕褐色。② 按阳性细胞所占比例评分：0分为阴性；1分为10%以下；2分为11%～50%；3分为51%～75%；4分为75%以上。每张切片以两者乘积判定阳性结果：0～2分为阴性(-)；3～4分为弱阳性(+)；5～8分为中度阳性()；9～12分为强阳性结果()，将≥3分定为阳性结果，<3分定为阴性结果。

1.4 统计学处理采用SPSS 23.0软件进行数据分析，计数资料用百分比或率表示，差异性分析采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。采用χ2检验对HOXA5、E-cadherin、β-catenin之间的相关性进行分析。

2 结果

2.1 常规病理切片HE染色镜下观正常输卵管：输卵管壁由浆膜、肌层与黏膜组成，输卵管黏膜上皮为单层柱状细胞，见图1A。高级别浆液性囊腺癌：肿瘤上皮高度增生，杂乱生长，相互搭连形成多种复杂的排列方式，可看到筛状或裂隙样结构衬覆，见图1B。低级别浆液性囊腺癌：乳头纤细、分支复杂。形成大量新的排列紊乱的上皮性乳头及小腺体。细胞密集、异型大，核分裂象多，间质较少，见图1C。高级别黏液性囊腺癌：腺样结构不明显，呈簇状或弥漫片状，细胞核异型性明显，核分裂象较多，见图1D。低级别黏液性囊腺癌：腺体不规则，大小不一，排列紧密，共壁、筛状，有浸润。上皮柱状或低柱状，结构紊乱，形成共壁，间质内大量癌细胞巢浸润，核分裂象较多，见图1E。

2.2 HOXA5、E-cadherin、β-catenin在不同组织中的表达HOXA5蛋白主要表达于细胞质，E-cadherin蛋白免疫组织化学染色以细胞膜着色为阳性，β-catenin蛋白免疫组织化学染色以细胞膜着色为阳性，见图2。

HOXA5、E-cadherin及β-catenin蛋白在卵巢癌组织的表达显著低于正常输卵管、卵巢组织(P=0.000，P=0.003，P=0.001)。HOXA5在卵巢良性肿瘤组织中的表达显著低于正常输卵管、卵巢组织(P=0.002)，E-cadherin及β-catenin在卵巢良性肿瘤组织和正常输卵管、卵巢组织间的表达差异无统计学意义(P=0.775，P=0.767)，见表1。

2.3 HOXA5、E-cadherin、β-catenin在卵巢癌中的表达及与临床病理参数间的关系HOXA5、E-cadherin、β-catenin在卵巢癌中的表达阳性率与年龄(P>0.05)、组织学类型(P>0.05)、临床分期(P>0.05)、发生部位(P>0.05)无显著关系，而与组织学分级(P=0.007，P=0.000，P=0.000)有关，组织分化越高，其表达率越高，见表2。

图1 常规病理切片HE染色镜下观 ×400

图2 HOXA5、E-cadherin、β-catenin在不同组织中的表达 ×400

A：正常输卵管；B：高级别浆液性囊腺癌；C：低级别浆液性囊腺癌；D：高级别黏液性囊腺癌；E：低级别黏液性囊腺癌；1：HOXA5；2：E-cadherin;3:β-catenin

表1 HOXA5、E-cadherin和β-catenin在正常卵巢、输卵管组织及卵巢良、恶性肿瘤组织中的表达[n(%)]

2.4 HOXA5、E-cadherin、β-catenin在卵巢癌中的表达相关性分析χ2检验提示在卵巢癌组织中，HOXA5的表达与E-cadherin(r=0.289,P=0.025)、β-catenin的表达呈正相关(r=0.293,P=0.023 )，见表3。

3 讨论

HOXA5基因正常表达可以维持上皮细胞的稳定及组织的正常分化。该基因的异常表达参与到多种恶性肿瘤的发生、发展，如白血病、乳腺癌等，参与大部分肿瘤的黏附、迁移、侵袭过程，是临床中值得关注的基因靶点。此外，国内外有文献[10]报道提示twist表达产物具有抗细胞凋亡的作用。在卵巢组织中，twist基因可抑制E-cadherin蛋白的表达[11]，而HOXA5基因表达产物又可抑制twist基因的表达[12]，当HOXA5表达下降，twist基因对E-cadherin蛋白的抑制作用增强，从而使E-cadherin蛋白表达下降，由此推测HOXA5基因很有可能通过调控twist基因的表达间接在Wnt信号通路中调控E-cadherin蛋白表达，进而起到抑制卵巢癌发生、发展的作用。且在林路 等[13]、于舒鸿 等[14]研究结果中有说明E-cadherin、β-catenin共同参与上皮细胞黏附复合体的形成，当E-cadherin或β-catenin表达下降或缺失，就会造成上皮细胞的黏附功能下降，从而导致肿瘤从原发部位脱落，向周边组织侵袭和浸润。Ordonez-Moran et al[15]指出HOXA5可通过与Wnt信号通路相互作用来调控肠干细胞的稳定及其分化过程，他们发现在肠隐窝中，Wnt信号通路通过抑制肠干细胞/祖细胞中的HOXA5来维持肠干细胞的稳定性；而在肠隐窝之外，HOXA5反向抑制Wnt信号通路，从而促进肠干细胞进行分化。

表2 HOXA5、E-cadherin及β-catenin在卵巢癌组织中的表达及与临床病理参数间的关系[n]

A：HOXA5、E-cadherin、β-catenin在浆液性癌与黏液性癌组织中的表达差异；b：HOXA5、E-cadherin、β-catenin在浆液性癌与其他组织学类型中的表达差异

表3 HOXA5、E-cadherin、β-catenin在卵巢癌中的表达及其相关性分析(n)

以上现有的研究大致可以说明HOXA5基因可以通过某些中介来影响E-cadherin、β-catenin蛋白在卵巢癌中的表达，本研究将HOXA5与β-catenin、E-cadherin作为一个整体进行研究，探讨它们在肠隐窝之外的卵巢癌组织中的表达，分析三者在卵巢癌组织中的表达相关性。

本研究结果显示，在卵巢癌组织中，HOXA5及E-cadherin、β-catenin蛋白表达水平明显低于正常输卵管、卵巢组织(P=0.000,P=0.003,P=0.001)，且在高级别卵巢癌和低级别卵巢癌中的阳性表达对比中(级别越高，卵巢癌分化越低)，级别越高，HOXA5及E-cadherin、β-catenin蛋白表达越低，差异有统计学意义(P=0.007,P=0.000,P=0.000)，提示HOXA5、E-cadherin、β-catenin与卵巢癌的病理分化过程、发生进展密切相关，这三者在卵巢组织中的表达下降往往导致卵巢肿瘤的形成及分化、恶化程度趋向于一个不良的预后。HOXA5与E-cadherin、β-catenin蛋白在卵巢癌中的表达成正相关(r=0.289,P=0.025；r=0.293,P=0.023)，提示可以通过上调HOXA5、β-catenin、E-cadherin蛋白的表达水平，用于预防肿瘤的形成，抑制癌组织进一步恶化，或通过阻断HOXA5与β-catenin、E-cadherin相互作用的通路，从而抑制卵巢癌的发生、发展，或通过检测HOXA5、β-catenin、E-cadherin的表达水平达到卵巢癌早期筛查的作用；这为卵巢癌的临床诊断和治疗提供了可供参考的理论基础，HOXA5基因有可能作为卵巢癌基因靶向药物治疗的靶点，为卵巢癌基因靶向治疗药物开发提供参考的理论依据。本实验的创新性主要在于把HOXA5、β-catenin、E-cadherin三者共同置于卵巢癌中研究且证明了它们之间的表达具有正相关性。至于HOXA5基因在卵巢癌中促进肿瘤发生发展的机制有待进一步研究。