超薄射流和低温等离子体协同膜组合系统对枯草芽孢杆菌沾染物的洗消效能研究

汪 勇，隋 韧，于乐成，陈 亚，魏 巍，鞠 晶，许兆林，贾绍昌，沙 亮，蒋 旻

在现代野战、恐怖袭击、突发生产安全事故或地震等重大自然灾害情况下，发生生物、化学、核辐射袭击或污染的风险增加[1-4]。一旦发生此类事件，对灾害现场人员、设备、物资及环境等进行高效节水洗消就是一个重大而现实的问题，及时有效地保护现场人员、控制污染扩散、为后续救援的开展奠定基础十分必要[5-6]。当前国内外的各种洗消装备至少存在两大方面的不足。其一是通常采用普通市售的淋浴喷头、水枪或喷雾器，耗水量大，洗消效率低[7-8]。其二是这些现有设备对使用过的废水缺乏良好的净化处理功能，水源不能充分循环利用，废水往往只能在一次性使用后集中收纳存储以待日后再行专门去污处理；且由于废水产生量大，其临时存储压力也随之增大。这两大方面的不足对野外或突发事件时缺水条件下的应急洗消尤为不利，是该领域亟需解决的重要问题。为此，我们通过医、工、理多学科协作，初步研发成功基于超薄射流（ultrathin jet stream, UJS）、低温等离子体（low temperature plasma, LTP）和协同膜处理相结合的集成模块洗消（washing, sterilization and decontamination, WSD）新技术平台，并试制了代号为UJS-LTP-WSD-1的新一代成套洗消验证系统——超薄射流和低温等离子体协同膜组合系统，以供对一系列不同种类的沾染对象进行洗消效果验证。炭疽芽孢杆菌是潜在的生物武器或恐怖袭击手段之一[9-11]，但不能以其进行洗消验证实验。因此，本研究以枯草芽孢杆菌作为替代，研究UJS-LTP-WSD-1系统中UJS模块对枯草芽孢杆菌沾染的多种物体和动物的洗消效果及节水能力，以及LTP协同膜模块对枯草芽孢杆菌菌液的净化处理能力。

1 材料与方法

1.1 材料 UJS-LTP-WSD-1系统1套（图1），含UJS喷头和普通淋浴喷头各1套。枯草芽孢杆菌菌株来自南京中医药大学微生物学和免疫学教研室。表面积为10 cm×10 cm的自制覆漆钢板2块、生猪皮2块，背部10 cm×10 cm去毛的雄性成年家兔2只。容量为2 L和6 L的洁净玻璃水槽各1只，直径90 mm的无菌培养皿，细菌培养基，超净台，无菌棉签，散射浊度计，自然温度市政生活自来水，煮沸后的自来水等。

图1 UJS-LTP-WSD-1系统A.方舱外观展示；B.UJS-LTP-WSD-1部分内部结构展示Figure 1 UJS-LTP-WSD-1 system

1.2 实验方案 UJS模块对枯草芽孢杆菌沾染物体和动物洗消效果的检验，分为UJS洗消组（UJS组）和普通洗消组（普通组）。LTP协同膜模块对枯草芽孢杆菌菌液去污净化处理能力的检验，比较去污净化处理前和去污净化处理后的枯草芽孢杆菌的检出数。

1.2.1 UJS-LTP-WSD-1系统洗消枯草芽孢杆菌沾染的覆漆钢板 分为UJS组和普通组。取高温消毒后的2 L水槽1只，装满煮沸后自然冷却至室温的自来水，再加入枯草芽孢杆菌菌液，使细菌浓度达到约1×103CFU/ml。将2块洁净的覆漆钢板浸入菌液浸泡至少2 min，使其充分沾染菌液。取沾染菌液的覆漆钢板，洗消前记录为对照组（记为0 s），然后分别用UJS喷头（水流速0.8 L/min，约合13.33 ml/s）和普通喷头（水流速2.4 L/min，约合40.00 ml/s）洗消10 s、20 s、30 s、40 s、60 s、90 s。在各时间点分别取样。每次取样时，每块钢板选3个不相邻的1 cm×1 cm正方形区域（用作重复试验，结果取3者的平均值），用无菌棉签充分拭取后，转移至直径为90 mm的装有适量培养基的圆形培养皿，37 ℃培养48 h。培养结束后，对各培养皿菌落进行计数，菌落数以CFU/cm2为单位，＞300 CFU/cm2视为极限水平，即菌落极多、难以准确计数。

1.2.2 UJS-LTP-WSD-1系统洗消枯草芽孢杆菌沾染的生猪皮 取2块洗净的生猪皮，按与1.2.1相同的程序进行实验和检测。每块生猪皮在各个时间点选取3个不相邻的1 cm×1 cm正方形区域取样检验，每个时间点的结果取3者的平均值。

1.2.3 UJS-LTP-WSD-1系统洗消枯草芽孢杆菌沾染的背部脱毛的雄性成年家兔 取洁净60 L水槽1只，装满煮沸后自然冷却至室温的自来水，加入枯草芽孢杆菌菌液，使细菌浓度达到约1×103CFU/cm2。将2只背部脱毛雄性成年家兔浸入水槽中，使其背部充分沾染菌液。然后按1.2.1的流程和方法进行洗消（图2）和检测。

1.2.4 UJS-LTP-WSD-1系统对枯草芽孢杆菌菌液的净化效果 取1只60 L水槽，装满煮沸后降至室温的生活用自来水后，加入枯草芽孢杆菌菌液，使细菌浓度达到约1×103CFU/cm2，然后经UJSLTP-WSD-1系统中LTP协同膜模块净化处理。用以下2种方法检验去污净化处理效果，每种检验方法在净化前和净化后均各取3份样品分别进行检测，结果取其平均值。

图2 应用UJS喷头和普通喷头洗消背部脱毛雄性成年家兔Figure 2 Decontamination of back-depilated adult male rabbits with the UJS sprayer and conventional sprayer

取净化前和净化后的水样各3 ml，分别加入9 ml灭菌肉汤培养基中，37 ℃培养48 h。培养结束后检测其浑浊度，并以无菌肉汤培养基作为空白对照进行对比。浑浊度以散射浊度单位（NTU）表示。

取经过LTP协同膜模块净化处理前的菌液、净化后的水样以及用作空白对照的无菌三蒸水各3 ml，分别加入直径为90 mm的无菌培养皿中，然后在每个培养皿中另加入45 ℃灭菌肉汤琼脂培养基，混匀并待其凝固，37 ℃培养48 h，培养结束后对各培养皿上的菌落进行计数。菌落数以CFU/cm2为单位。

1.2.5 UJS-LTP-WSD-1系统节水效能评估 UJSLTP-WSD-1的节水效能首先是UJS模块的直接节水效能。其次是经LTP协同膜模块去污净化处理过的水资源的再利用，虽然在水源充足时不必利用再循环水，但在野外缺水的紧急情况下则非常重要和必要。本研究主要分析UJS模块的直接节水效能，根据检测结果可选用以下方法之一进行评估。

方法一：Rw=[（V2×T2-V1×T1）/（V2×T2）]×100%。其中，Rw 为UJS组的节水率，V1为UJS组的水流速（13.3 ml/s），T1为UJS组刚好检测不出细菌所需的时间（s），V2为普通组的水流速（40 ml/s），T2为普通组刚好检测不出细菌所需的时间（s）。本法适用于2组在设定洗消时间内均能达到检测不出细菌的情况。

方法二：Rw=[（V2×Rb-V1）/（V2×Rb）]×100%。其中，Rw 为UJS组的节水率，V1为UJS组的水流速（13.3 ml/s），V2为普通组的水流速（40 ml/s），Rb为普通组菌落数相对于UJS组菌落数的平均倍数。Rb=开始洗消后各时点平均菌落数的比值之和/时点数。本法适用于在设定的试验时间内以下任一种情况：①UJS组检测不出细菌而普通组仍能检出细菌的情况，时点数的计算跨度从第1个洗消时点（10 s）计算至UJS组检测不出细菌的上一时点；②2组均未达到检测不出细菌的情况。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0软件进行统计学处理。采用重复测量设计资料的方差分析来比较UJS组和普通组之间随时间变化的菌落检出数是否有差别。不满足Mauchly球形分布时，则采用多变量方差分析检验各组间和各时间点是否有显著性差异。同组数据≥3个不同时间点菌落数均值的比较采用单向方差分析。2组间同一时间点检测结果的比较采用2样本均数的t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。因菌落数＞300 CFU/cm2时无法准确计数，故对应时间点的菌落数据均不列入统计学比较。

2 结 果

2.1 UJS模块对枯草芽孢杆菌沾染物的洗消效果

2.1.1 UJS模块对枯草芽孢杆菌沾染覆漆钢板的洗消效果 对于枯草芽孢杆菌沾染覆漆钢板的洗消检验结果见表1和图3。重复测量设计资料的方差分析显示，2组洗消效果均随时间延长而显著降低枯草芽孢杆菌的检出数（F=11 711.416，P=0.000），而UJS组的洗消效果显著优于普通组（F=250.436，P=0.004）。

表1 UJS组和普通组对枯草芽孢杆菌沾染覆漆钢板的洗消效果（CFU/cm2）Table 1 UJS sprayer and conventional sprayer decontamination efficacy on the paint-coated steel plates contaminated by Bacillus subtilis(CFU/cm2)

图3 UJS组和普通组对枯草芽孢杆菌沾染覆漆钢板的洗消效果对比Figure 3 Comparison of the UJS sprayer and conventional sprayer decontamination efficacy on the paint-coated steel plates contaminated by Bacillus subtilis

2.1.2 UJS模块对枯草芽孢杆菌沾染生猪皮的洗消效果 对于枯草芽孢杆菌沾染生猪皮的洗消效果见表2。UJS组在洗消时间≤30 s时，菌落极多而不可计数，从第40 s开始菌落数随时间延长而迅速显著下降（F=376.559，P=0.000）。普通组在洗消时间≤60 s时，菌落极多而不可计数，从第90 s时可以计算出准确菌落数。2组第90 s结果相比，差异有统计学意义（t=-13.865，P=0.000）。

2.1.3 UJS模块对枯草芽孢杆菌沾染背部脱毛雄性成年家兔的洗消效果 对于枯草芽孢杆菌沾染背部脱毛雄性成年家兔的洗消效果见表3。2组基线培养菌落数极多而不可计数，但分别在洗消10 s和20 s后可计算准确菌落数。重复测量设计资料的方差分析显示，2组枯草芽孢杆菌的检出数在第20～90 s均随时间延长而显著降低（F=2564.986，P=0.015），UJS组的洗消效果显著优于普通组（F=38.960，P=0.003）。

2.2 LTP协同膜模块对枯草芽孢杆菌菌液的去污净化效能 肉汤培养基培养显示（见表4），经LTP协同膜模块处理前的枯草芽孢杆菌菌液样品的浑浊度显著高于处理后样品和无菌肉汤培养基的浑浊度（P＜0.05），处理后样品与无菌肉汤培养基的浑浊度相似（P＞0.05）。固体培养基培养结果显示，枯草芽孢杆菌菌液（菌落数＞300 CFU/cm2）经LTP协同膜模块处理后，未能培养出任何菌落。

2.3 UJS-LTP-WSD-1系统节水效能评估

2.3.1 UJS模块洗消枯草芽孢杆菌沾染覆漆钢板的节水效能 根据方法一，UJS组和普通组分别在洗消40 s和90 s时培养菌落数为0，因此Rw=[（40.0×90-13.3×40）/（ 40.0×90）]×100%=85.2%。

根据方法二，应计算10 s、20 s、30 s共3个时间点的菌落均数比值的平均值，因此Rb=（35.7/10.0+12.3/3.7+7.0/2.0）/3=3.5。 由 此推算Rw=（40.0×3.5-13.1）/（40.0×3.5）×100%=90.5%。

2种计算方法的结果基本接近，第二种方法计算结果略偏高。

2.3.2 UJS模块洗消枯草芽孢杆菌沾染生猪皮的节水效能 本部分数据只有第90 s时2组均有可数的菌落。为减少取单次菌落均值之比可能导致Rb过高，进而导致估算节水率过高的风险，对普通组第60 s的菌落数按300 CFU/cm2推算。根据方法二，Rb=（300/222.3+225.0/34.7）/2=3.9。 由 此 推 算Rw=（40.0×3.9-13.3）/（40.0×3.9）×100%=91.5%。

2.3.3 UJS模块洗消枯草芽孢杆菌沾染背部脱毛雄性成年家兔的节水效能 根据方法二，计算第20 s、30 s、40 s、60 s、90 s共5个时间点菌落均数比值的均值，因此Rb=（209.3/115.0+86.0/42.3+45.7/24.3+27.0/19.3）/4=1.8。由此推算Rw=（40.0×1.8-13.3）/（40.0×1.8）×100%=81.5%。

3 讨 论

随着国际安全环境的恶化和全球自然灾害的频繁发生，生物、化学、核辐射袭击或突发事故的风险时刻存在。一旦发生此类事件，如何对受袭或受灾人员和环境进行快速有效的洗消处理，以帮助相关人员及时脱离沾染和防控沾染蔓延是人们高度关注的问题[3-5]。因此，野战洗消和净化技术及装备研究就成为现代卫勤保障研究的重要内容之一。卫生防疫车、消毒喷洒车、燃气射流车、新型淋浴车、防化侦察车、检验箱组、防护服、防毒面具等已在我军相关部队推广使用并发挥着重要作用。但由于发展基础薄弱，起步较晚，与美国、德国等发达国家相比，我国的洗消和净化装备体系还远不够完善，研制平台相对滞后，性能与国外存在较大差距，距离实现强有力的保障目标还有很大差距，因此亟需加强这方面的研究。

表2 UJS组和普通组对枯草芽孢杆菌沾染生猪皮的洗消效果（CFU/cm2）Table 2 UJS sprayer and conventional sprayer decontamination efficacy on raw pig skins contaminated by Bacillus subtilis(CFU/cm2)

表3 UJS组和普通组对枯草芽孢杆菌沾染的背部脱毛成年雄性家兔的洗消效果（CFU/cm2）Table 3 UJS sprayer and conventional sprayer decontamination efficacy on the back-depilated adult male rabbits contaminated by Bacillus subtilis(CFU/cm2)

表4 浊度测定法评估LTP协同膜模块对枯草芽孢杆菌菌液的净化效果（NTU）Table 4 Purifying effects of LTP-collaborative membrane on the Bacillus subtilis-containing suspension detected by turbidity assay(NTU)

炭疽芽胞杆菌历来是可能被应用的潜在生物武器之一[9-11]。由于在通常情况下采用炭疽芽胞杆菌进行洗消效果的验证具有较大的潜在风险和严格的生物安全防控要求，因此本研究采用枯草芽孢杆菌模拟炭疽芽胞杆菌沾染进行洗消和净化处理效果的研究。结果显示，UJS-LTP-WSD-1系统的多项洗消参数显著优于普通洗消装置。主要体现在以下四大方面。

第一，高效的洗消效果。这在3种洗消对象中均获得体现。该效果主要得益于特制的UJS喷头模块，该喷头具有可调扇形超薄射流水面、可调射流速度的特点。在设定的沾染条件下，对于覆漆钢板，UJS喷淋洗消在40 s时即能获得理想效果，而普通喷淋洗消在90 s后才能获得类似效果。对生猪皮，在洗消90 s时，UJS组可检测到的菌落数显著低于普通组。对背部脱毛雄性成年家兔的脱毛部位的洗消，UJS组在90 s时菌落接近检测不出，而普通组仍能检测到约20.3 CFU/cm2的菌落数。

第二，理想的污水净化能力。UJS-LTPWSD-1系统设计了可串联应用的三重去污净化机制。其一是LTP。LTP是一种较新的灭菌手段，已被证明具有很强的杀灭微生物的作用，对细菌繁殖体、芽孢、真菌、病毒、原虫甚至细菌毒素都有很好的杀灭或灭活效果，已越来越多地应用于医学仪器消毒和空气净化等方面[2，12-15]。其二是协同膜结构，包括超滤膜和反渗透膜，可有效滤除细菌、真菌、病毒乃至生物毒素。其三是活性炭结构，可根据需要开放或关闭连接。检测结果显示，在设定的条件下，污水一次性经过本集成模块的处理，几乎可以完全去除病原菌。这提示，经本设备处理过的污水，检测无害后可直接排放至环境而不必贮集后再处理，在极端缺水的情况下还可以作为再循环水重复利用，从而进一步增加了UJS-LTP-WSD-1的供水自持能力。

第三，强大的节水性能。这不仅得益于科学设计的UJS喷头模块，也得益于LTP+协同膜±活性炭模块的功能。通过合理的推算显示，在设定的沾染条件下，达到同等洗消效果时，UJS喷头相对于普通喷头的节水量在覆漆钢板可达85.2%～90.5%，在生猪皮可达91.5%，在背部脱毛雄性成年家兔可达81.5%。而如果同时考虑到在野战、恐怖袭击或特发重大安全事故时净水可持续供应的困难，则LTP+协同膜±活性炭模块必将在很大程度上通过污水净化再循环利用而缓解上述问题，同时大大缓解需要收集大批污水废水和后期处理困难的问题。

第四，集成模块化设计。这种设计的好处是，可以根据洗消对象和洗消环境等的不同，进行比较灵活的调整，从而适应多场景的需求。换言之，各模块的形状和尺寸可以根据重点针对的不同环境进行调整；也可以根据不同的需要进行模块数量的调整，比如增加UJS模块的数量或增加LTP+协同膜±活性炭模块的数量。

此外，本研究还显示，待洗消的对象不同，洗消效率也有很大差别。覆漆钢板易于洗消，而生猪皮和背部脱毛雄性成年兔相对需要更长的洗消时间，提示应用UJS-LTP-WSD-1系统时也应根据洗消对象的不同来调节UJS扇面、速度和时间，以便取得最佳洗消效果。

总之，UJS-LTP-WSD-1系统是一种拥有多项完全自主知识产权、集成多种先进技术、可进行高效节水洗消和污水净化处理的新型技术平台，代表了在野战和突发事件等条件下应对生物、化学、核辐射袭击或事故的新型移动式三防技术平台的一大发展方向，可有效提升处置这类突发情况的能力，值得进一步优化设计和扩大验证。