鳜鱼传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）的快速PCR检测方法灵敏性的比较

朱春艳，王家军，薛中仪，刘张淮，张荧荧

（宝应县水生动物疫病预防控制中心，江苏 宝应 225800）

近年来，鳜鱼传染性脾肾坏死病毒病（ISKN）给鳜鱼养殖业造成了严重损失。中山大学何建国等证实了鳜鱼的传染性脾肾坏死病病原为传染性脾肾坏死病毒（ISKNV），属于虹彩病毒。ISKNV感染鳜鱼脾、肾、肝、鳃、心脏和消化道等组织器官，其中，脾和肾是其主要感染器官[1-2]。一般被ISKNV感染的发病鱼常表现为游泳异常的症状，鳃丝失血发白，肝脏呈黄色或浅白色，有出血点；肾脏肿大充血；脾脏充血，部分伴有出血等现象。由于水生动物病毒类疾病目前尚无特效治疗药物[3]，因此在生产环节中对病原的早期诊断和及早处理带毒动物体等生产资料对科学养殖指导工作有着重要的意义。

目前，中华人民共和国农业部发布实施了SC/T 7211-2011《传染性脾肾坏死病毒检测方法》行业标准，在生产中也已经广泛应用。但行业标准中完成DNA提取和PCR检测的方法耗时较长。该实验室在集成DNA快速提取技术、快速PCR技术基础上，建立了一种简便快速的PCR检测法，能在3 h内完成组织DNA提取、PCR扩增、电泳、凝胶成像，得出检测结果，更大程度满足渔业生产需求，尤其适用于县级水产疫病防控实验室。该方法该试验在鳜鱼传染性脾肾坏死病毒快速检测方面已有初步验证。为进一步验证该快速检测方法的灵敏性，该实验室开展了快速检测方法的灵敏性比较的实验，现将试验过程及结果总结如下。

1 材料与方法

1.1 仪器

DK-8D型水浴锅（上海森信实验仪器有限公司生产）；MIKRO200R型台式高速冷冻离心机（德国Hettich公司生产）；S1000型PCR仪（美国B10-RAD公司生产）；BG-Power600型电泳仪（北京万向旭通科技有限公司生产）；INFINITY-3026型凝胶成像系统（法国VILBER公司生产）。

1.2 试剂

Chelex-100%（sigma-aldrich公司生产）；proteaseK、2KDNAMarker、灭菌双蒸水和 2*EasyTayPCR SuperMix（均为北京全式金生物技术有限公司生产）、DNA提取试剂盒（Code No.9765，TaKaRa公司生产）。

1.3 检测样品

发病塘口采集的濒死发病鳜鱼（具有典型传染性脾肾坏死病症状且经过电镜和PCR双重确认感染ISKNV）3尾，取鱼的肾、脾组织2 g加2 mL PBS冰浴研磨。用PBS分别稀释101~109倍。分别取100 μL不同浓度的稀释液作为待检样品；阳性对照为研磨原液；阴性对照为从未受ISKNV感染的鳜鱼，且电镜和PCR双重检测确认ISKNV阴性的鱼肾脏组织研磨液。

1.4 样品DNA提取

1.4.1 Chelex-100法[6]各取100μL待检样品、阳性对照、阴性阴性对照分别置于1.5 mL离心管内，加入200 μL 5%Chelex-100悬浊液和20μL蛋白酶K，混匀10 s，56℃水浴20 min，混匀10 s，99℃水浴8 min，4℃环境下12 000 rpm离心4 min，上清液即为DNA溶液，需耗时约40 min。

1.4.2 试剂盒法 各取100μL待检样品、阳性对照、阴性阴性对照置于1.5mL离心管内，加入180μLBuffer GL、20μL Proteinase K 和 10 μL RNase A（10 mg/mL），于56℃水浴2 h至组织完全裂解（难裂解的适当延长裂解时间，裂解之后先12 000 rpm离心2 min，去除杂质之后再进行后续操作）。向裂解液中加入200μL Buffer GB 和 200 μL 100%乙醇，充分吸打混匀。将Spin Column安置于Collection Tube上，溶液移至Spin Column中，12 000 rpm离心2 min，弃滤液。将500 μL的Buffer WA加入至Spin Column中12 000 rpm离心1 min，弃滤液。将700 μL的Buffer WB加入至Spin Column中，12 000 rpm离心1min，弃滤液。重复加Buffer WB1次，弃滤液。将Spin Column安置于Collection Tube上，12 000 rpm离心2 min。将Spin Column安置于新的1.5 mL的离心管上，在 Spin Column膜的中央处加入 50～200 μL Elution Buffer（水浴至 65℃），室温静置 5 min。12 000 rpm离心2 min洗脱DNA。洗脱液即为DNA溶液。耗时约3 h。

1.5 PCR反应

1.5.1 快速PCR法 参考文献[4]设计和合成引物：ISKNV-FOR（5’-GCATGTATGCTGTTTAGACA-3’）和 ISKNV-REV（5’-AGCATCAAGCAGGCGATCTG-3’），扩增真鲷虹彩病毒（RSBV）核苷酸还原酶小亚单位（RNRS）基因187 bp片段。

总反应体系 25 μL，其中包含：模板 DNA 1 μL，2×EasyTayPCRSuperMix12.5μL，正反引物各1μL，灭菌双蒸水 9.5 μL。

PCR反应程序为：94℃预变性3 min；94℃变性 3 s、56 ℃退火 15 s、72 ℃延伸 10 s，35次循环；72℃延伸10 min；4℃保温。需耗时约1 h。

1.5.2 标准PCR法[5]参考传染性脾肾坏死病毒检测方法（SC/T7211-2011）合成引物：ISKNV-F2（5’-CGTGAGACCGTGCGTAGT-3’）和 ISKNV-R2（5’-AGGGTGACGGTCGATATG-3’），扩增ISKNV主衣壳蛋白（MCP）基因562 bp片段。

总反应体系 50 μL，其中包含：模板 DNA 2.5 μL，2×*EasyTay PCR SuperMix 25 μL，正反引物各 1 μL，灭菌双蒸水 20.5 μL。

PCR反应程序为：94℃预变性2 min；94℃变性30 s、61℃退火45 s、72 ℃延伸1 min，30次循环；72℃延伸7 min；4℃保温。需耗时约1 h 40 min。

1.6 电泳与凝胶成像检测

取6 μL反应液在1%琼脂糖凝胶上电泳，110 V，电泳25 min。取电泳后的凝胶置于凝胶成像系统，根据UV 254 nm下观察187 bp的DNA条带和562的DNA条带的有无判断检测结果。

2 结果

用Chelex-100法提取模板快速PCR法扩增结果显示当病毒组织原液稀释103倍PCR扩增结果仍为阳性，模板稀释104倍PCR扩增结果则为阴性（图1）。

图1 Chelex-100法提DNA，快速PCR法扩增结果

用Chelex-100法提取模板标准PCR法扩增结果显示当病毒组织原液稀释102倍PCR扩增结果仍为阳性，模板稀释103倍PCR扩增结果则为阴性（图2）。

用试剂盒法提取模板快速PCR法扩增结果显示当病毒组织原液稀释107倍PCR扩增结果仍为阳性，模板稀释108倍PCR扩增结果则为阴性（图3）。

用试剂盒法提取模板标准PCR法扩增结果显示当病毒组织原液稀释105倍PCR扩增结果仍为阳性，模板稀释106倍PCR扩增结果则为阴性（图4）。

3 讨论

经比较，相同试验条件下快速PCR法与标准PCR法相比不仅减少了扩增时间，且扩增效果较好。

图2 Chelex-100法提DNA，标准PCR法扩增结果

图3 试剂盒法提DNA，快速PCR法扩增结果

图4 试剂盒法提DNA，标准PCR法扩增结果

文中灵敏性试验结果显示Chelex-100法的提取效率没有商品试剂盒的提取效率高，可能因为Chelex-100法制得的DNA粗提液溶解液较多约320 μL；而试剂盒法制得的DNA粗提液溶解液仅为80 μL，即使DNA含量相同，在作为模版扩增时吸取相同体积的DNA提取液，Chelex-100法的DNA含量较少，故检测灵敏性相较于试剂盒法较低。如何提高Chelex-100法DNA提取效率，有待进一步探索。Chelex-100法虽然目标DNA提取效率没有商品试剂盒法高，但是该法具有简单快速、清洁无毒、检材用量少等特点[6-8]，在实际运用中也存在一定的优势。在发病塘口（当病毒含量达到一定含量）快速诊断时Chelex-100法更加快速便捷且检出效果较好。但在鳜鱼苗种快速检疫中，建议使用试剂盒法提取DNA结合快速PCR法检测，以防漏检。