珐菲亚Pfaffia glomerata和Pfaffia paniculata形态学及化学成分的差异△

赵颖，路娟，柴瑞平，吕欣锴，陈曦

中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193

珐菲亚(Pfaffia)，又称巴西人参(Brazilian ginseng)，为苋科珐菲亚属多年生草本植物[1]，全世界共约90个种[2]，主要分布在南美洲巴西等国家热带雨林地区。该属植物主要药用部位是根，有壮阳、镇静、抗肿瘤、治疗溃疡、风湿性关节炎和降血糖等功效，已有300多年应用史，是当地民间一种重要药用植物[3]。其中Pfaffiapaniculata(Martius)Kuntze和Pfaffiaglomerata(Sprengel)Pedersen，是这一种属在巴西最商业化的药用植物，均被称为巴西人参[4-5]，文献报道P.glomerata为巴西南部P.paniculata的代用品[4-5]。

珐菲亚的化学成分主要包括三萜及三萜皂苷类，甾酮、甾醇及其皂苷类[1]。此外，珐菲亚还富含多种氨基酸、维生素等[1，7]。其中蜕皮甾酮作为一种能够增进机能的物质[8]，是珐菲亚中最主要的植物蜕皮甾体[9]。有报道称，蜕皮甾酮只在P.glomerata中存在[10]，并被用作鉴定该物种的标准。但实验前期发现，蜕皮甾酮同样存在于P.paniculata中。同时化学研究表明，在珐菲亚中含有超过其干质量11%的皂苷成分[10]。为进一步对比P.glomerata和P.paniculata两种珐菲亚化学成分的不同，笔者采用高效液相色谱法、比色法和氨基酸自动分析仪对珐菲亚中蜕皮甾酮、总皂苷和氨基酸的含量进行了测定，并考察了不同提取部位中蜕皮甾酮和总皂苷的含量差异，同时从外观形态以及微观结构对P.glomerata和P.paniculata进行了初步的比较。

1 材料

1.1 仪器

Waters UPLC H-Class系统(含四元溶剂泵、自动进样装置、在线真空脱气装置、PDA检测器、Empower2色谱工作站)；Cary100UV-Vis变温紫外分光光度计(美国Agilent公司)，日立L-8900全自动氨基酸分析仪；AB265-S十万分之一天平(瑞士Mettler Toledo公司)；YS-10小型高速粉碎机(北京燕山正德机械设备有限公司)；DRYFAST实验室隔膜泵(威伊真空设备有限公司)；GZX-9030MBE电热鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；HC-2518高速离心机(安徽中科中佳科学仪器公司)；DZKW-4电子恒温水浴锅(林茂科技有限公司)；KQ-250E型超声波清洗器(昆明市超声仪器公司)；ASP200S浸蜡机、EG1150H包埋机、RM2245切片机、HI1210展片机、ST5020染色机(德国LEICA公司)；PS-53烤片机(日本SAKURA公司)。

1.2 试药

Pfaffiaglomerata和Pfaffiapaniculata(宁波珐菲亚食品股份有限公司)；蜕皮甾酮(纯度98%，上海融禾医药科技发展有限公司，批号：180617)；人参皂苷Rb1(纯度98%，上海融禾医药科技发展有限公司，批号：171018)；乙腈(色谱纯，美国Merk公司，CAS-No：75-05-8)；甲醇(色谱纯，美国Merk公司，CAS-No：67-56-1)；无水乙醇、冰醋酸(北京化工厂，批号分别为：20170223、20170502)；高氯酸；屈臣氏蒸馏水(GB19298)；盐酸(北京化工厂，批号：20170826)；苯酚、柠檬酸钠、香草醛(国药集团化学试剂，批号分别为：20171020、20170418、20161110)；石蜡(Leica，Lot.1411063)、L-天冬氨酸(Asp，批号：121027)、L-谷氨酸(Glu，批号：121107)、L-丝氨酸(Ser，批号：121109)、L-甘氨酸(Gly，批号：121024)、L-精氨酸(Arg，批号：121102)、L-苏氨酸(Thr，批号：121126)、L-脯氨酸(Pro，批号：121031)、L-丙氨酸(Ala，批号：121105)、L-缬氨酸(Val，批号：121125)、L-异亮氨酸(Ile，批号：121013)、L-亮氨酸(Leu，批号：120929)、L-苯丙氨酸(Phe，批号：120922)、L-赖氨酸(Lys，批号：121126)、L-酪氨酸(Tyr，批号：121108)、L-组氨酸(His，批号：121030)均购于上海融禾医药科技发展有限公司，纯度≥98%。

2 方法与结果

2.1 石蜡切片法比较药材根形态学观察

2.1.1 药材外观差异P.glomerata表面灰黄色，具纵皱纹，质较硬，断面淡黄白色。P.paniculata表面棕黄色，具纵皱纹，主根及支根有明显的疣状突出，质稍硬，断面棕黄色。见图1。

注：A.P.glomerata；B.P.paniculata。图1 P.glomerata和P.paniculata外观形态观察

2.1.2 药材石蜡切片方法 取材→FAA固定液(50%乙醇-冰醋酸-福尔马林，体积比90∶5∶5)固定1周→脱水(依次50%、70%、85%、95%、100%、100%乙醇每级0.5～1 h)→透明(50%二甲苯+50%无水乙醇、纯二甲苯每级2 h)→浸蜡机浸蜡→包埋→切片、贴片→展片→染色观察。

2.1.3 石蜡切片结果 通过对P.glomerata和P.paniculata的根进行石蜡切片制作，并在显微镜下观察了2种珐菲亚根的切片，进一步从解剖学上比较2种珐菲亚根组织结构(见图2)。

注：A.P.glomerata；B.P.paniculata；a.薄壁细胞；b.维管束；c.木质部导管；d.韧皮部。图2 P.glomerata和P.paniculata外观形态观察

通过观察发现，P.glomerata薄壁细胞形状相对规则，排列紧密有序；维管束结构清晰，木质部导管结构可见。P.paniculata薄壁细胞形状相对不规则，排列松散，维管束结构较少。

2.2 HPLC测定药材不同提取部位中蜕皮甾酮的含量

2.2.1 对照品溶液的配制 精密称取蜕皮甾酮对照品10 mg，用甲醇定容至10 mL容量瓶中，于4 ℃冰箱中保存，备用。

2.2.2 供试品溶液的配制 将珐菲亚药材P.glomerata和P.paniculata根部于粉碎机中粉碎为粗粉，精密称取1 g于具塞锥形瓶，分别加入50 mL蒸馏水、50%乙醇水、75%乙醇水，称定质量，超声40 min，冷却，称质量，补足质量，摇匀，分别取10 mL，12 000 r·min-1离心10 min，取上清液过0.22 μm微孔滤膜，备用。

2.2.3 色谱条件 采用Waters XBridge RP18色谱柱(250 nm ×4.6 mm，5 μm)，流动相A：乙腈，流动相B：水，梯度洗脱(0～17 min，3%～35%A；17～20 min，35%～75%A；20～25 min，75%～100%A)；流速0.8 mL·min-1；柱温25 ℃；检测波长265 nm；进样量10 μL。在上述色谱条件下，色谱图见图3。

注：A.蜕皮甾酮对照品溶液；B.P.glomerata供试品水溶液；C.P.paniculata供试品水溶液。图3 蜕皮甾酮对照品及珐菲亚供试品的HPLC图

2.2.4 线性关系考察 精密吸取2.2.1项下蜕皮甾酮对照品溶液0.12、0.14、0.18、0.3、0.36、0.4 mL，分别置于2 mL容量瓶中，用甲醇定容，即得系列对照品溶液，溶液过0.22 μm微孔滤膜，按2.2.3项下色谱条件进样，测得峰面积。分别以蜕皮甾酮对照品峰面积值为纵坐标(Y)，蜕皮甾酮对照品质量浓度为横坐标(X)，绘制标准曲线，得回归方程：Y=8 176 297X-59 818，r=0.999 5。结果表明，蜕皮甾酮在62.82～209.4 mg·L-1线性关系良好。

2.2.5 精密度试验 取蜕皮甾酮对照品溶液(98.46 mg·L-1)，按2.2.3项下色谱条件进行测定，重复6次，记录色谱峰，计算得色谱峰面积的RSD值为1.8%，说明该仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 取同一份供试品溶液，按2.2.3项下色谱条件分别于0、2、4、8、12、24 h 进样测定，记录峰面积，结果RSD为1.9%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.7 重复性试验 取P.glomerata根部粗粉6份，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，2.2.3项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算含量。结果蜕皮甾酮含量的RSD值为1.7%，表明本方法具有良好的重复性。

2.2.8 加样回收率试验 取已知含量的P.glomerata根部粗粉6份，每份0.5 g，精密称定，分别精密加入2.5 mg·mL-1蜕皮甾酮对照品溶液1 mL，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，2.2.3项下色谱条件进样测定，结果平均回收率为98.1%，RSD为1.8%。

2.2.9 样品测定 分别称取P.glomerata和P.paniculata药材根部粉末约1 g，平行3份，精密称定，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.2.3项下色谱条件进样测定，计算样品中各提取部位的蜕皮甾酮的含量，并采用t检验对结果进行差异显著性分析。结果见表1。

表1 蜕皮甾酮含量测定结果 mg·g-1

注：与P.glomerata比，**P<0.01。

2.3 UV测定药材中总皂苷的含量

2.3.1 对照品溶液的配制 精密称定人参皂苷Rb1对照品5 mg于5 mL容量瓶中，用甲醇定容即得。

2.3.2 供试品溶液的配制 分别精密称取P.glomerata和P.paniculata根部粉末各2 mg于具塞试管中，加5%香草醛-冰醋酸0.4 mL和高氯酸1.6 mL，摇匀，于100 ℃水浴中加热20 min后取出，立即以冰浴冷却5 min，加入冰醋酸8 mL摇匀，在540 nm处检测吸光度值。

2.3.3 测定波长的选择 取360 μL人参皂苷Rb1对照品溶液于具塞试管中，氮气吹干，加5%香草醛-冰醋酸0.4 mL和高氯酸1.6 mL，摇匀，于100 ℃水浴中加热20 min后取出，立即以冰浴冷却5 min，加入冰醋酸8 mL摇匀，立即在紫外分光光度计于400～800 nm波长下扫描，同时空白溶液作参比，对照品溶液在540 nm处有最大吸收，由此确定检测波长为540 nm。

2.3.4 线性关系考察 精密吸取对照品溶液120、160、200、240、280、320、360、400、440 μL于试管中，氮气吹干，加5%香草醛-冰醋酸0.4 mL和高氯酸1.6 mL，摇匀，于100 ℃水浴中加热20 min后取出，立即以冰浴冷却5 min，加入冰醋酸8 mL摇匀，在540 nm处读取吸光度值。以吸光度为纵坐标(Y)，以浓度为横坐标(X)，绘制标准曲线，得回归方程Y=0.027 6X-0.136，r=0.995 7。结果表明，总皂苷在13.03～43.44 mg·L-1线性关系良好。

2.3.5 样品测定 分别称取P.glomerata和P.paniculata药材根部粉末约2 mg，平行3份，精密称定，按照2.3.2项下方法制备供试品溶液，并计算样品中各提取部位的总皂苷的含量，采用t检验对结果进行差异显著性分析。结果见表2。结果表明，2种珐菲亚药材的总皂苷的含量存在显著性差异。

表2 总皂苷含量测定结果 mg·g-1

注：与P.glomerata比，**P<0.01。

2.4 氨基酸自动分析仪测定药材中15种水解氨基酸及总氨基酸的含量

2.4.1 色谱条件 分离柱：4.6 mm×60 mm标准分析柱，带保护柱；磺酸型阳离子树脂：No.2622，3 μm(日本日立公司)；反应柱柱温：135 ℃；分离柱柱温：57 ℃；缓冲液流速0.4 mL·min-1，反应液流速0.35 mL·min-1；检测波长：第1通道570 nm，第2通道440 nm；进样体积：20 μL。

2.4.2 混合氨基酸标准工作液的配制 精密称取单个氨基酸对照品于同一50 mL烧杯中，用8.3 mL 6 mol·L-1盐酸溶液溶解，精密转移至250 mL容量瓶中，用水稀释定容至刻度，混匀，得到浓度为1 μmol·mL-1的混合氨基酸对照品储备液。准确吸取混合氨基酸对照品储备液0.8 mL于10 mL容量瓶中，加pH 2.2柠檬酸钠缓冲溶液定容至刻度，混匀，过0.22 μm微孔滤膜，备用。

2.4.3 供试品溶液的配制 分别精密称取0.2 g的P.glomerata和P.paniculata药材根部粉末于水解管中，加入10 mL的6 mol·L-1盐酸溶液，滴入3滴苯酚，充氮后封管，置于(110±1)℃的电热鼓风恒温箱内水解22 h后，冷却至室温，水解液过滤后用水定容至50 mL容量瓶中。准确吸取1.0 mL 滤液，N2吹干，pH 2.2柠檬酸钠缓冲溶液稀释到5 mL，过0.22 μm微孔滤膜备用。

2.4.4 试样的测定 混合氨基酸标准工作液和供试品溶液分别以相同体积注入全自动氨基酸分析仪，以外标法通过峰面积计算供试品溶液中氨基酸的含量(结果见表3)。

(1)

其中A：样液峰面积，A0：标液峰面积，C标：标液浓度，V：样品定容体积，m：称样质量，f：稀释倍数，X：被测物质质量浓度。

表3 药材中15种水解氨基酸的含量 g·(100 g)-1

注：与P.glomerata比，**P<0.01。

3 讨论

石蜡切片是用石蜡作为包埋剂的一种显微制片方法，是植物显微技术上最重要也是最常用的一种方法，在植物的解剖学及其相关领域的生产及科研中均有广泛的应用[12]，可用于观察正常细胞组织的形态结构，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。采用石蜡切片法制备得到的中药材切片可永久保存。

蜕皮甾酮作为一种能够增进机能的物质[8]，是珐菲亚中最主要的植物蜕皮甾体[9]，有报道称蜕皮甾酮只在P.glomerata中存在[10]，并被用作鉴定该物种的标准。但实验结果表明，蜕皮甾酮同样存在于P.paniculata中。在选择色谱流动相时，分别对有机相(甲醇、乙腈)和水相(纯水、甲酸水)的不同组合进行了考察，结果显示，乙腈-水作为流动相，能够使色谱峰达到完全分离，可以在较短的时间内实现基线分离。在样品处理过程中，均将不同批次的样品集中粉碎，混匀后称取样品，避免了由于药材个体差异带来的误差；同时比较了超声提取和回流提取2种不同提取方法，结果显示，超声提取与回流提取效果相似，考虑到操作的简便性与实用性，最终选择超声提取。本文通过HPLC建立了快速测定珐菲亚中蜕皮甾酮的方法，该方法分离效果理想，重复性好。

有报道称珐菲亚中主要的成分是皂苷[13]，为对比这2种珐菲亚皂苷成分的差异，实验采用了比色法对比药材各提取部位中总皂苷的含量。因目前国内尚无法菲亚皂苷类成分的法定对照品，实验选用了与珐菲亚皂苷类成分基本母核结构接近的人参皂苷Rb1为对照品，结果表明，总皂苷的含量在不同种属珐菲亚的不同提取部位中存在差异。

目前氨基酸检测的研究方法有很多种[14-15]，包括分光光度法、气相色谱法、液相色谱法等。其中基于高效阳离子交换色谱-柱后茚三酮衍生法形成的全自动氨基酸分析仪是目前氨基酸检测最常用的方法之一。珐菲亚化学成分研究表明，珐菲亚中含有多种氨基酸[7]，为进一步比较2种珐菲亚化学成分的差异，采用全自动氨基酸分析仪比较了2种属氨基酸含量的差异。结果表明，P.paniculata所含的各氨基酸及总氨基酸含量均高于P.glomerata。

本实验对2种珐菲亚形态学及主要的化学成分蜕皮甾酮、总皂苷、氨基酸的含量均进行了差异性的比较，结果表明，珐菲亚形态学差异明显，蜕皮甾酮、总皂苷及氨基酸的含量存在显著性差异，为珐菲亚药材的质量控制与评价提供了理论依据。