45味中药对多重耐药大肠杆菌的抑菌效果△

李海华，郭蔚冰，陈志强*，青梅，付丽云，张远达，蔡小利

1.内蒙古华天制药有限公司，内蒙古 赤峰 024070；2.内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特 010110

抗生素类药物在人类医疗行业[1]和动物养殖行业[2-3]中传染病的预治方面有着重要作用，人类和动物的医疗防治已经离不开抗生素的使用。无限制地使用抗生素使得细菌为确保生存优势，产生和衍变耐药基因[4]，进而使得多重耐药菌[5]得以生存并繁衍。多重耐药菌的复杂性导致临床感染性疾病难以治疗。目前，许多国家已严禁抗生素在养殖业中的使用，但其给抗感染的治疗带来了一些不便。因此，如何选择一种不产生耐药性的抗菌药物来替代或者减少抗生素的应用成为当今人们思考和研究的热点。我国运用中医药治疗疾病历史悠久，研究结果显示[6-8]，一些中草药及其活性成分确实具有抗菌、抑菌活性，可改善和逆转细菌的耐药性，将这些中药重新组方，制成制剂，开发新药[9]，进而为畜牧业中常见的大肠杆菌感染和其他细菌感染性疾病的防治研究提供有力的支撑。

1 材料

1.1 菌种来源

21株分离自鹅，7株分离自羊，15株分离自猪的致病性大肠杆菌，均购自于内蒙古民族大学动物科学与技术学院微生物实验室。标准大肠杆菌(44102)购于中国兽医微生物菌种保藏管理中心。

1.2 仪器与试剂

LDZX-75KBS立体式压力蒸汽灭菌器、DH4000型电热恒温培养箱、MH琼脂培养基购自北京奥博星生物科技有限公司。

1.3 药物

左氧氟沙星、盐酸多西环素、硫酸安普霉素、盐酸沙拉沙星、氨苄西林、恩诺沙星、乳酸诺氟沙星、硫酸新霉素、氟苯尼考、盐酸环丙沙星、阿莫西林、硫酸庆大霉素和硫酸黏菌素均由内蒙古华天制药有限公司提供；白头翁、板蓝根、瓜蒌、茵陈、博落回、赤芍、马齿苋、穿心莲、苦参、栀子、水杨梅、诃子、大青叶、山豆根、丹参、地锦草、甘草、黄柏、黄芪、金银花、龙胆草、青蒿、山楂、乌梅、五味子、黄连、仙鹤草、野菊花、八角茴香、柴胡、大黄、党参、干姜、黄芩、藿香、荆芥、桔梗、千里光、连翘、芦荟、石榴皮、益母草、淫羊藿、鱼腥草和紫雏菊均购于安国市玉丞中药材有限公司，并由内蒙古医科大学药学院青梅教授鉴定为正品。

2 方法

2.1 耐药菌株筛选试验

参考《欧盟药敏试验标准》操作规程，制备药敏片。采用K-B法检测43株病源大肠杆菌对13种抗菌药的敏感性，观察含药滤纸片周围有无抑菌环，直接测量其直径，用(mm)记录，参照《欧盟药敏试验标准》中细菌的药物敏感性试验的“抗菌药物的抑菌环与敏感标准”判定其敏感、中介和耐药情况。按照药敏试验结果(耐药率≥70%)筛选多重耐药菌株。

2.2 中药提取方法

称取上述45味中药各50 g，加入500 mL 的蒸馏水浸泡2 h，微沸煎煮2次，每次1.5 h，过滤，合并滤液，浓缩至50 mL，生药质量浓度为1 g·mL-1，高压蒸气灭菌，备用。

2.3 大肠杆菌悬液制备

将多重耐药菌株接种于肉汤培养管中，置37 ℃恒温培养箱中培养16～20 h，采用麦氏比浊法配制菌悬液，用0.9%氯化钠溶液稀释至浓度为105CFU·mL-1，备用。

2.4 中药体外抑菌活性实验

采用牛津杯法测定45味中药提取液对大肠杆菌的抑菌直径[9]，往直径12 cm的无菌培养皿内倒入20～25 mL已灭菌的营养琼脂培养基，无菌条件下静置凝固备用。用移液枪吸取100 μL大肠杆菌悬液注入已凝固的培养基上并涂布均匀，然后在培养皿上等距放置4个牛津杯，用移液枪往其中3个牛津杯分别注入100 μL药材提取液，另一个加入同等体积的无菌0.9%氯化钠溶液作为空白对照，将上述平皿放在恒温培养箱内，于37 ℃培养18～20 h，测量并记录抑菌圈直径。抑菌效果判定标准是参照陈静等[10]药敏实验的标准进行判定，以抑菌圈直径>20 mm为高敏；抑菌圈直径为10～20 mm为中敏；抑菌圈直径<10 mm为不敏感。

2.5 中药最小抑菌浓度的测定实验

采用试管二倍稀释法，取12支试管为1组，置于试管架上，用移液抢吸取5 mL营养肉汤于每支试管内，再另取移液管吸取5 mL中药药液(1 g·mL-1)于第1支试管内，抽吸3次，使药液与肉汤混匀，再从每组第1管吸取5 mL混匀液到每组2管中，如此类推一直到第11管，再从第11管中吸取5 mL混匀液舍去，第12管为细菌对照组，不加药液。即每组试管中的药液质量浓度分别为0.5、0.25、0.125、0.063、0.032、0.016、0.008、0.004、0.002、0.001、0.000 5 g·mL-1。

将以上混匀液置于培养箱中37 ℃恒温培养24 h，观察混匀液是否发生浑浊，发生浑浊则判定为细菌增殖，不发生浑浊则判定为增殖受到抑制。细菌增殖受到抑制的最小药物浓度即判定为该药物的最小抑菌浓度(MIC)。以此测定各味中药提取物对不同耐药菌株的最小抑菌浓度。

3 结果

3.1 不同来源多重耐药大肠杆菌对抗菌药物的敏感性实验结果

根据43株来自于鹅源、羊源和猪源的大肠杆菌对13种抗生素类药物药敏实验结果中筛选出耐药性较高并且多重耐药的大肠杆菌7株，其药敏实验结果见表1。

3.2 7株不同来源多重耐药菌株对45味中药的敏感性结果

以45味中药提取液(1.0 g·mL-1)为研究对象，采用牛津杯法，考察其对7株不同来源的多重耐药菌株的体外抑菌活性，测定抑菌圈直径，统计表现为中敏和高敏中药的抑菌圈直径结果，见表2。部分中药的药敏实验结果见图1。

注：A1、A2.赤芍；B1、B2.荆芥；C1、C2.黄柏；D1、D2.乌梅；E1、E2.水杨梅；F1、F2.黄芩；G.马齿苋；H.诃子；J1、J2：山楂；K1、K2.博落回。图1 部分中药对3号大肠杆菌的敏感性实验结果

3.3 10味高敏中药最小抑菌浓度测定结果

从45味中药中选取平均抑菌圈直径大于20 mm(高敏)的中药，共10味，作为研究对象，采用试管二倍稀释法测定其对不同来源的多重耐药大肠杆菌的最小抑菌浓度，结果见表3。

表1 7株不同来源多重耐药的大肠杆菌对13种抗菌药的药敏实验结果

注：0表示耐药；1表示中介；2表示敏感。

表2 17味中药对多重耐药菌株的抑菌圈测定结果 mm

表3 10味高敏中药的最小抑菌浓度结果 mg·mL-1

根据最小抑菌浓度实验结果，对10味中药对不同来源(鹅、羊和猪)的多重耐药菌的抑菌效果进行分析，结果见图2。

图2 10味中药对不同来源耐药菌株抑制作用

4 讨论

4.1 耐药菌株的耐药性分析

实验结果表明，实验筛选出的7株不同来源的多重耐药大肠杆菌对13种抗菌药物的耐药率均大于69.21%；其中来自于鹅源、羊源和猪源各有1株大肠杆菌的耐药率已达到84.62%；实验中所应用的抗菌药物均为畜牧业生产实践中常用药物，如此严重的大肠杆菌耐药性的现状，应该与抗菌药物在临床的长期滥用相关。

恩诺沙星、多西环素、阿莫西林、氨苄西林对多数的多重耐药菌株已几乎无效，耐药率达85.71%。这也是兽医临床部分细菌性疾病单一抗生素治疗效果不佳的原因之一。同时也说明临床致病大肠杆菌对抗菌药物的耐药性已十分严峻。

硫酸黏菌素对多重耐药菌株仍有较好的抑制效果，有效率可达85.71%。其原因应与硫酸黏菌素的作用机理有关。硫酸黏菌素可以与细胞膜脂蛋白游离磷酸盐结合，使得细胞膜表面张力减小、通透性增加，导致胞浆外流、细胞死亡。其抗菌作用部位的特异性不高，不易产生耐药性。

此外，以实验筛选出7株多重耐药菌株作为研究对象具有一定代表性和重要意义。

4.2 7株不同来源多重耐药菌株对45味中药的敏感性结果分析

根据抑菌圈直径大小分析可知，7株不同来源多重耐药菌株对白头翁、板蓝根、穿心莲、大青叶、丹参、地锦草、甘草、瓜蒌、黄芪、金银花、茵陈、龙胆草、千里光、青蒿、仙鹤草、苦参、野菊花、栀子、大黄、党参、干姜、藿香、连翘、芦荟、益母草、淫羊藿、鱼腥草和紫雏菊28味中药表现为不敏感；对八角茴香、柴胡、黄芩、荆芥、桔梗、石榴皮和山豆根7味中药表现为中敏；对博落回、山楂、水杨梅、赤芍、黄柏、五味子、乌梅、黄连、马齿苋和诃子10味中药表现为高敏。具有抑菌效果的17味中药的抑制作用强弱依次为：博落回>黄连>水杨梅>乌梅>马齿苋>诃子>黄柏>赤芍>山楂>五味子>柴胡、桔梗、石榴皮、黄芩、荆芥、山豆根、八角茴香；博落回、黄连、水杨梅的抑菌圈直径分别可达35.3、32.2、27.2 mm，抑菌效果较理想。结果与大部分报道的结果一致[10-12]。其中，水杨梅抑制大肠杆菌增殖的效果鲜见报道。

4.3 10味高敏中药最小抑菌浓度测定结果分析

10味中药的最小抑菌浓度实验结果表明：体外抑菌效果最好的是博落回，平均最小抑菌浓度约为3.63 mg·mL-1；其次是黄连，平均最小抑菌浓度为8.37 mg·mL-1；第三是水杨梅，平均最小抑菌浓度为10.04 mg·mL-1；其他7味中药平均最小抑菌浓度由小到大依次为：乌梅、马齿苋、诃子、黄柏、赤芍、山楂和五味子；不同中药最小抑菌浓度实验结果表明其抑菌效果趋势与测定抑菌圈直径大小实验结果相符。不同中药对来源于鹅、羊和猪的多重耐药菌株抑制作用不同，同一中药对不同来源的多重耐药大肠杆菌的抑菌效果有所差别，但差别不显著。结果说明中药对大肠杆菌的增殖抑制作用机制不同于西药抗菌药物，中药抑制大肠杆菌的作用具有非特异性，不易产生耐药性。

4.4 中药对于细菌性疾病的应用前景分析

近几年，中药逆转耐药性的机制作为中药抗菌研究的一个新的领域悄然兴起，中药具有抑制、延缓和消除细菌耐药性的作用[13-15]，研究中药单体[16]和中药复方制剂[17-18]抑菌或逆转耐药性实验众多，例如：陈静等[10]对11味中药对痤疮丙酸杆菌的体外抑制作用进行研究，结果表明，痤疮丙酸杆菌对黄连高敏，对黄柏、黄芩、丹参、半枝莲中敏。芦亚君等[19]通过3种中药方剂逆转大肠杆菌耐药性的实验证明了三黄汤、黄连解毒汤和五味消毒饮有逆转细菌耐药性的作用。除了上述实验研究，还有许多研究结果均证明，部分中药及中药制剂对其他菌种，如金黄色葡萄球菌[11]、嗜水气单胞菌[20]、肺炎克雷伯菌和真菌[21]等不同种类和不同来源[12，22-24]的致病菌和耐药菌均具有较理想的抑制作用。同时，中药还具有疗效好、毒副作用小、价格低廉、制备工艺简便、不易产生耐药性等特点，在未来势必会被广泛应用，为人类和动物的临床疾病的防治增添新的希望。

5 结论

本实验筛选的45味中药中博落回、山楂、水杨梅、赤芍、黄柏、五味子、乌梅、黄连、马齿苋和诃子10味中药对大肠杆菌的抑制作用表现为高敏；八角茴香、柴胡、黄芩、荆芥、桔梗、石榴皮和山豆根7味中表现为中敏；其他28味中药表现为不敏感。

本实验所筛选的45味中药，抑菌效果最好的3味中药依次为博落回、黄连和水杨梅，最小抑菌浓度依次为3.63、8.37、10.04 mg·mL-1。

实验结果表明，中药对于不同动物体内分离到的致病性大肠杆菌的抑制作用差异不显著。中药对于大肠杆菌的抑制作用具有显著的非特异性。

实验结果表明，中药对多重耐药菌株具有明显的抑制效果，但是，中药对于大肠杆菌的体外抑制实验结果不能说明该中药对于疾病的治疗效果。针对不同类型的大肠杆菌引起的疾病，仍需动物实验和临床试验等进一步研究。本实验为中药在大肠杆菌病的治疗研究上提供了重要的基础依据。