复方龙脉宁磷脂复合物的基本性质及初步吸收评价△

翟思程，史亚军，王景媛

1.陕西科技大学 镐京学院，陕西 咸阳 712046；2.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046

复方龙脉宁(以下简称CL)方是陕西中医药大学第一附属医院脑病科陶根鱼教授的经验方，处方由葛根、川芎、穿山龙、蜂胶(除去蜂蜡[1])四味中药组成，在临床应用多年，治疗气滞-血瘀型冠心病效果显著。虽然CL的活性成分有确切的药理效应，但作为需要长期口服的药物，其有效成分的水溶性、脂溶性均较差，导致CL的生物利用度较低。文献研究表明[2]，含羟基的有效成分与磷脂在一定条件下进行结合，得到磷脂复合物的理化性质和生物特性与原化合物相比均有不同程度的改变，且磷脂复合物具有较强的亲脂性，可以有效改善机体对药物的吸收，具有显著的生物有效性。本实验将CL提取物与大豆卵磷脂进行复合，对CL提取物进行改性，对葛根中的葛根素、川芎中阿魏酸、穿山龙中薯蓣皂苷、蜂胶中的白杨素进行含量测定，对各成分含量进行加权，以加权结果E为指标，对CL复合物和提取物的基本性质及离体肠吸收效果进行比较，为提高CL方的生物利用度提供理论依据。

1 材料

1.1 仪器

UV紫外分光光度计(日本岛津公司)；高效液相色谱仪(Dionex Ultimate 3000)，Thermo C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；台式离心机(Thermo Scientific Heraeus Labofuge 400R)；万分之一分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；磁力搅拌器(金坛市白塔金昌实验仪器厂78-1)；真空干燥箱(上海欣齐科学仪器有限公司DZF-6050)。

1.2 试药

葛根素对照品(批号：110773-201012，纯度≥98%，中国食品药品检定研究院)；大豆卵磷脂(批号：040801，PC≥82%，上海太伟药业)；甲醇、乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为蒸馏水；乌拉坦(批号：75-01-03，上海化学试剂采购供应站)；CL提取物及CL磷脂复合物为自制；Krebs-Ringer’s液为自制。

1.3 实验动物

SD大鼠(220±20)g 60只，SPF级，雌雄各半，由第四军医大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(军)2014-0007，SPF级饲养室内饲养，期间自由饮水、摄食，室温20～25 ℃，相对湿度40%～70%，光照周期12L∶12D，通风良好。

2 方法与结果

2.1 CL提取物及磷脂复合物的理化性质考察

2.1.1 色谱条件 1)葛根素的测定，流动相：甲醇-水(25∶75)；检测波长：250 nm；流速：1 mL·min-1；柱温：30 ℃；时间：25 min；进样量：10 μL。2)阿魏酸的测定[3]，流动相：甲醇-0.1%磷酸水(30∶70)；检测波长：321 nm；流速：1 mL·min-1；柱温：30 ℃；时间：23 min；进样量：20 μL。3)薯蓣皂苷的测定，流动相：乙腈-水(55∶45)；检测波长：203 nm；流速：1 mL·min-1；柱温：30 ℃；时间：13 min；进样量：10 μL。4)白杨素的测定[4]，流动相：甲醇-0.1%磷酸水(64∶36)；检测波长：268 nm；流速：1 mL·min-1；柱温：30 ℃；时间：22 min；进样量：30 μL。

2.1.2 CL磷脂复合物的制备及复合率的计算 称取CL提取物[5]3 g，大豆卵磷脂9 g，加入无水乙醇500 mL，置于40 ℃恒温磁力搅拌器中搅拌12 h，减压回收乙醇，真空干燥，即得。前期实验研究表明，CL提取物难溶于甲苯，而磷脂及CL磷脂复合物易溶于甲苯，利用这一特点，计算CL磷脂复合物的复合率。精密称定M1(约1 g)CL磷脂复合物，加入20 mL甲苯，30 min内每5 min强力振荡一次，以完全溶解其中的磷脂及复合物，以3000 r·min-1的转速离心10 min，取清液转移至已恒重的蒸发皿中，减压回收甲苯，称定质量M2。

复合率(%)=[M2-(M1-M2)×λ]/M1×100

(1)

式中：M1为磷脂复合物质量，M2为磷脂复合物溶于甲苯的质量，λ为磷脂与药物质量比，计算出CL磷脂复合物的复合率为86.72%。

2.1.3 对照品溶液的制备 1)葛根素对照品溶液的制备：精密称取葛根素对照品12.8 mg，用甲醇溶解，定容至25 mL，制成对照品储备液。精密吸取储备液1 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容得质量浓度为51.2 mg·L-1的葛根素对照品溶液。分别进样4、8、10、12、16、20 μL对照品溶液，以葛根素峰面积(Y)对质量(X)进行线性回归，得回归方程Y=964 725X+46 102，r=0.998 6(n=6)，表明葛根素在0.20～1.02 μg线性关系良好。2)阿魏酸对照品溶液的制备：精密称取阿魏酸对照品16.6 mg，用70%甲醇溶解，定容至25 mL，得到对照品储备液。精密吸取对照品储备液1 mL于10 mL容量瓶中，用70%甲醇定容，得到质量浓度为66.4 g·L-1的对照品溶液。分别进样4、8、10、12、16、20 μL，以阿魏酸峰面积(Y)对质量(X)进行线性回归，得回归方程：Y=23 381X-11 505，r=0.999 7(n=6)。表明阿魏酸在0.27～1.33 μg线性关系良好。3)薯蓣皂苷对照品溶液的制备：精密称取薯蓣皂苷对照品3.75 mg，用乙腈溶解，定容至10 mL，得到质量浓度为0.375 g·L-1的对照品溶液。分别进样4、8、10、12、16、20 μL，以薯蓣皂苷峰面积(Y)对质量(X)进行线性回归，得回归方程：Y=55 548X-2397，r=1.000(n=6)。表明薯蓣皂苷在1.50～7.50 μg线性关系良好。4)白杨素对照品溶液的制备：精密称取白杨素4.0 mg，用甲醇溶解，定容至10 mL，得到对照品储备液。精密吸取对照品储备液1 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到质量浓度为40 mg·L-1的对照品溶液。分别进样1、3、5、7、9 μL，以峰面积(Y)对质量(X)进行线性回归，得回归方程：Y=23 649X-16 319，r=1.000(n=5)。表明白杨素在0.04～0.36 μg线性关系良好。

2.1.4 方法学试验 专属性试验显示，葛根素、阿魏酸、薯蓣皂苷和白杨素分离良好，在空白样品处无吸收，专属性良好。精密度试验显示，葛根素、阿魏酸、薯蓣皂苷和白杨素峰面积RSD均小于2%，仪器精密度良好。稳定性试验表明，样品在24 h内稳定。

2.1.5 紫外光谱分析 取适量CL提取物、磷脂、磷脂复合物以及与复合物配比相同的提取物与磷脂的物理混合物，分别溶解于无水乙醇，以无水乙醇为空白，对各样品在200～400 nm用紫外光谱进行全波长扫描，结果见图1。

注：A.磷脂；B.CL提取物；C.CL磷脂复合物；D.CL提取物与磷脂的物理混合物。图1 紫外吸收图谱

由紫外图谱可知，磷脂在扫描范围内没有吸收，而CL提取物、复合物和物理混合物的紫外吸收光谱最大吸收均在253 nm左右，且形状相似。

2.1.6 CL提取物与磷脂复合物溶解性的比较 分别称取过量CL提取物、CL提取物与大豆卵磷脂的物理混合物、CL磷脂复合物于水或正辛醇的具塞锥形瓶中，置于37 ℃恒温水浴摇床中，充分振荡48 h，使各样品充分溶解并达到饱和。取出后以3000 r·min-1的速率离心10 min，取上清液，过0.45 μm微孔滤膜，采用HPLC分别测定3份样品中葛根素、阿魏酸、薯蓣皂苷、白杨素的含量，按2.1项下色谱条件进样分析，得到CL提取物中各成分含量比值为葛根素∶阿魏酸∶薯蓣皂苷∶白杨素=8∶1∶0.5∶0.5。实验以各成分含量比值为权重系数，对各成分含量测定结果进行加权，计算E值。样品在水和正辛醇中的表观溶解度见表1～2。

E=(8K1+K2+0.5K3+0.5K4)/10

(2)

K1、K2、K3、K4分别代表葛根素、阿魏酸、薯蓣皂苷、白杨素的值。

表1 样品在水中的表观溶解度 g·L-1

表2 样品在正辛醇中的表观溶解度 g·L-1

加权结果表明，磷脂复合物中各成分在水中的表观溶解度是提取物中各成分的5.24倍，提取物与磷脂的物理混合物中各成分在水中的表观溶解度是提取物中各成分的3.32倍；磷脂复合物中各成分在正辛醇中的表观溶解度是提取物中各成分的44.56倍，提取物与磷脂的物理混合物中各成分在正辛醇中的表观溶解度是提取物中各成分的35.38倍。

2.1.7 CL提取物与磷脂复合物表观油水分配系数的确定 分别于100 mL容量瓶中配制一定浓度的CL提取物及其磷脂复合物的水溶液，充分溶解后，分别精密移取20 mL于100 mL磨口锥形瓶中，再精密移取20.0 mL水饱和正辛醇，加塞封口，于37 ℃恒水浴摇床中以100 r·min-1的速度连续振摇24 h，分别精密移取水层和正辛醇层溶液2 mL，测定各成分含量，得到E值，计算水层中各成分浓度ρw，正辛醇层中各成分浓度为ρo，实验及结果见表3。

表观油水分配系数P=ρo/ρw

(3)

从结果可知，CL磷脂复合物中的各成分的油水分配系数比提取物中的提高了1.56倍。

2.2 CL提取物及磷脂复合物的离体肠吸收研究

本研究采用大鼠离体肠囊外翻法，观察CL提取物与磷脂复合前后各成分从外翻小肠囊黏膜侧向浆膜侧跨膜转运量的变化，以此为依据评价小肠对CL改性前后的吸收作用。

2.2.1 Krebs-Ringer’s液(K-R液)的制备 NaCl 7.8 g、KCl 0.35 g、CaCl20.37 g、NaHCO31.37 g、NaH2PO40.32 g、MgCl2·6H2O 0.043 g、D-Glucose 1.4 g，加蒸馏水稀释至1000 mL。

2.2.2 空白肠液的制备和样品处理方法 1)空白肠液的制备，按2.2.5项下方法制作“外翻小肠肠囊”模型，但肠囊内外均只放置空白K-R液，实验结束时一次性收集空白肠液2 mL。2)样品处理方法，取200 μL空白肠液或含药肠液，加入等量的6%高氯酸溶液，旋涡振荡2 min，13 000 r·min-1离心10 min，取上清液即得空白肠液或含药肠液的待测样品，取20 μL进样进行检测。

2.2.3 方法学考察 专属性试验显示，按2.2.2项下方法处理空白肠液及分别加入葛根素、阿魏酸、薯蓣皂苷、白杨素加药样品，进行HPLC检测，结果表明，肠液中的杂质峰与检测药物峰分离良好，大鼠肠液中的内源性杂质对检测结果无干扰，专属性良好。精密度和回收率试验结果表明，按2.2.2项下方法分别制备空白肠液，向空白肠液中分别加入高、中、低3个不同浓度点的葛根素、阿魏酸、薯蓣皂苷、白杨素溶液，按2.2.2项下样品处理方法进行处理，每个浓度点平行配制5份，连续测定3 d，计算得各药物的日内及日间精密度RSD值均<5%，各药物精密度良好，方法回收率良好。稳定性试验表明，样品在24 h内稳。

2.2.4 标准曲线的制作 1)葛根素标准曲线的绘制，准确吸取0.5 mL大鼠空白肠液，置于2 mLEP离心管中，加入2.1.3项下葛根素对照品溶液0.5 mL，旋涡振荡，按2.2.2项下方法行处理，按2.1.1项下色谱条件，分别进样4、8、10、12、16、20 μL对照品溶液，以葛根素峰面积(Y)对质量(X)进行线性回归，得回归方程Y=897 423X-16 701，r=0.999 3(n=6)，表明葛根素在0.10～0.51 μg线性关系良好。2)阿魏酸标准曲线的制备，准确吸取0.5 mL大鼠空白肠液，置于2 mLEP离心管中，加入2.1.3项下阿魏酸对照品溶液0.5 mL，旋涡振荡，按2.2.2项下方法处理，按2.1.1项下色谱条件，分别进样4、8、10、12、16、20 μL，以阿魏酸峰面积(Y)对质量(X)进行线性回归，得回归方程：Y=24 153X-10 502，r=0.999 7(n=6)，表明阿魏酸在0.14～0.67 μg线性关系良好。3)薯蓣皂苷标准曲线的制备，准确吸取0.5 mL大鼠空白肠液，置于2 mLEP离心管中，加入2.1.3项下的薯蓣皂苷对照品溶液0.5 mL，旋涡充分，按2.2.2项下方法处理，按2.1.1项下色谱条件，分别进样4、8、10、12、16、20 μL，以薯蓣皂苷峰面积(Y)对质量(X)进行线性回归，得回归方程：Y=62 535X-5122，r=1.000 0(n=6)，表明薯蓣皂苷在0.75～3.75 μg线性关系良好。4)白杨素标准曲线的制备：准确吸取0.5 mL大鼠空白肠液，置于2 mL EP离心管中，加入2.1.3项下的白杨素对照品溶液0.5 mL，旋涡振荡，按2.2.2项下方法处理，按2.1.1项下色谱条件，分别进样1、3、5、7、9 μL，以峰面积(Y)对质量(X)进行线性回归，得回归方程：Y=25 144X-16 229，r=0.996 1(n=5)。表明白杨素在0.02～0.18 μg线性关系良好。

2.2.5 大鼠离体肠囊外翻模型的制备 大鼠禁食不禁水12 h，用4%乌拉坦腹腔注射麻醉(2.0 mL·kg-1)，沿腹中线剪开腹腔，取从幽门处起始15 cm段小肠(十二指肠)，置于装有37 ℃的K-R液培养皿中，通入氧气。向小肠中注入K-R液充分排除小肠腔中内容物，再将小肠腔完全翻转，使得小肠的黏膜侧朝外，浆膜侧朝内[6]。小肠的一端用无血管损伤缝线结扎至不漏液，另一端接注射器的圆钝端口，扎牢，接上取样器，往肠腔内定量注入2 mL的K-R液，将肠囊垂直置于含质量浓度均为5 mg·mL-1的CL提取物改性前后的300 mL、37 ℃K-R液的锥形瓶中，并使小肠囊内外的液面相平。采用磁力搅拌器在37 ℃下恒温搅拌，并充分通氧，分别于第15、30、45、60、90、120、150、180、240、300 min，取30 μL的肠腔内液，同时补充同体积K-R液，按2.2.2项下方法处理待测样品，取20 μL进样，检测葛根素、薯蓣皂苷、阿魏酸、白杨素的含量，计算E值，以E值为指标计算单位面积累积渗透量(Q)和稳态透膜速率(Jss)。

根据公式(4)计算各个时间点CL磷脂复合物的Q(μg·cm-2)。

Q=CV/2πrL

(4)

式中，C为各个取样点的肠浆膜侧E值计算得出的CL质量浓度(μg·mL-1)，V为肠囊内液体积(2 mL)；r为小肠半径(0.18 cm)，L为肠囊实际长度。

将以上各样品的Q对渗透时间t进行回归处理，根据公式(5)计算稳态透膜速率Jss(μg·cm-2·h-1)。

Jss=(Q/t)×60

(5)

2.2.6 透膜吸收结果 不同时间段的Q见表4，不同时间段单位面积释药曲线见图2。药物透过小肠黏膜的药物稳态流量(Jss)，滞后时间和表观渗透系数(Papp)结果见表5。

表4 不同时间段的 μg·cm-2

图2 不同时间段单位面积释药曲线

由表4、5，图2可知，CL提取物及磷脂复合物均能透过大鼠小肠黏膜，且磷脂复合物溶液在每个时间点透过的浓度高于提取物。前12 min每个样品的接受池中均检测不到药物，证明每个样品在渗透时均有一定的滞留时间。药物的Q对时间呈良好的线性关系，符合一级动力学方程。最后300 min的Q为磷脂复合物>提取物。

3 结论

紫外光谱分析结果表明，CL提取物、复合物及提取物和磷脂的混合物的发色基团未发生改变，提示没有形成新的化合物[7]；溶解性结果表明，CL磷脂复合物在水和正辛醇中的溶解性相较于CL提取物显著提高，且高于CL提取物与磷脂的物理混合物，这表明CL磷脂复合物的复合不是简单的物理混合。根据实验结果，结合文献研究[8]推测，CL磷脂复合物是由提取物中的羟基与大豆卵磷脂分子通过电荷迁移作用形成较为稳定的化合物或络合物，课题组将对CL磷脂复合物的结构进行进一步研究。CL磷脂复合物既改善了CL提取物的水溶性又改善了脂溶性，水溶性的改善可能与复合物在水中形成胶团有关，脂溶性的改善可能是由于磷脂的极性部位与提取物相互作用，从而形成了一定的掩蔽作用。

CL提取物及其磷脂复合物中葛根素的表观油水分配系数的结果表明，提取物与磷脂复合后可以提高葛根素的表观油水分配系数，但因为形成磷脂复合物后葛根素的水溶性、脂溶性同时增强，所以表观油水分配系数增加程度不显著。

离体肠吸收结果表明，CL磷脂复合物溶液的累积渗透量和稳态透膜速率都远远高于提取物溶液，主要原因是CL与磷脂复合后，磷脂复合物的水溶性、脂溶性同时得以大幅度提高。磷脂复合物透过大鼠十二指肠的滞后时间与提取物相比，明显缩短，这是由于卵磷脂作为细胞膜的基本构成，与细胞膜的亲和力更强，其与有效成分结合可以使药物更易透过细胞膜被肌体吸收。

研究结果表明，CL磷脂复合物既没有改变原化合物的结构，又显著提高了CL的累计渗透量和稳态透膜速率，透过小肠的滞后时间明显缩短，这对提高CL方的生物利用度提供了理论支持。

表5 药物稳态流量与表观渗透系数的测定