化浊解毒方对溃疡性结肠炎大鼠血清IL-1β、IL-8含量及结肠黏膜NF-κB mRNA表达的影响

李博林， 赵丹阳， 杜朋丽， 才艳茹， 何芳， 景璇， 杨倩， 胡婧楠， 李刚

（河北省中医院，河北石家庄 050011）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种病因尚不明确的慢性炎症性疾病，病变主要累及结、直肠部位，临床表现以黏液脓血便、腹痛、腹泻、里急后重为主。近年来，随着生活方式、饮食结构的不断改变，我国UC发病率呈逐年上升的趋势[1]。本病病程长、易反复，严重影响患者生活质量。目前多认为该病与遗传因素、环境因素、免疫因素等有关[2]。在UC的致病因素中，免疫功能异常成为近年来研究的热点之一，尤其是核因子κB（NF-κB），其参与介导了一系列免疫炎症反应，在UC的发生发展中起重要作用[3]。本课题组前期临床观察发现UC的主要病机为浊毒内蕴[4]，以此立论的化浊解毒方治疗UC疗效确切[5-8]，但其具体作用机制尚不明确。基于此，本研究观察化浊解毒方对UC模型大鼠血清IL-1β、IL-8及黏膜组织NF-κB mRNA表达的影响，以探讨其作用机制，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物 8周龄清洁级雄性Wistar大鼠60只，体质量（120±20）g，购自河北医科大学实验动物中心，生产许可证号：SCXK（冀）2015-1-003，动物合格证号：1710300。于室温20～25℃饲养，湿度50%～70%，予普通饲料适应性喂养7 d后分组造模。

1.2 药物 化浊解毒方（组成：佩兰15 g，藿香12 g，茵陈蒿15 g，凤尾草15 g，飞扬草15 g，泽泻6 g，苍术12 g，厚朴6 g，胡黄连12 g，石榴皮12 g，地榆15 g，儿茶6 g，乌梅9 g，仙鹤草15 g，白芍15 g，佛手12 g），是由广州一方制药有限公司提供的免煎颗粒制剂。将药物溶于80℃的蒸馏水中，配成质量浓度为5 g/mL的混悬液备用。美沙拉嗪肠溶片，规格为0.25 g/片，国药准字H19980148，由葵花药业集团佳木斯鹿灵制药有限公司提供，研钵研成细粉，溶于蒸馏水配成0.3 g/kg溶液。

1.3 试剂与仪器 2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS；美国Sigma公司）；无水乙醇（天津永大化学试剂有限公司）；白细胞介素（IL）-1β、IL-8酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒（深圳晶美生物工程有限公司）；逆转录—聚合酶链式反应（RT-PCR）试剂盒（日本TaKaRa公司）。酶联免疫检测仪（芬兰雷伯公司）；实时荧光PCR定量仪（美国Thermo Fisher仪器有限公司）；低温离心机（美国Sigma公司）；光学显微镜（日本Olympus公司）；HMIAS-2000显微图像分析系统（武汉同济医科大学）。

1.4 模型制备 将60只雄性Wistar大鼠按照随机数字表分为正常组15只和造模组45只。采用TNBS/乙醇复合法建立UC大鼠模型[9]。具体操作方法：将5%TNBS与50%乙醇等体积混合为造模剂，造模组大鼠禁食不禁水24 h后称质量，乙醚麻醉；将造模剂按照4 mL/kg的剂量用直径约2 mm橡胶管推入距离肛门约6～8 cm的肠腔内，提起大鼠尾部倒置30 s，再捏紧大鼠肛门平放8～10 min。正常组予相同体积9 g/L NaCl溶液。造模结束后，将大鼠放回笼内，常规饲养。造模期间，造模组大鼠死亡1只。造模3 d后，于造模组随机抽取大鼠2只，断头处死，取结肠组织镜下观察，若见水肿、充血、糜烂、溃疡形成等病理改变，即可判断造模成功。

1.5 分组及给药 将造模成功的42只大鼠按照随机数字表随机分为3组，即UC模型组、美沙拉嗪组及化浊解毒方组，每组14只。根据“动物与人体的每公斤体质量剂量折算系数表”计算大鼠灌胃中药剂量，成人与大鼠的折算系数为6.25，大鼠每日用药剂量=成人每日用药总量/一般成人体质量（60 kg）×6.25。化浊解毒方组：给予化浊解毒方混悬液（剂量为20.0 g·kg-1·d-1）灌胃；美沙拉嗪组：给予美沙拉嗪混悬液（剂量为0.3 g·kg-1·d-1）灌胃；正常组：常规饲养；UC模型组：给予9 g/L NaCl溶液（剂量为4.0 mL·kg-1·d-1）灌胃。连续给药14 d。

1.6 标本采集及处理 连续给药14 d后，各组大鼠禁食不禁水24 h，称质量后予水合氯醛麻醉，开腹，股动脉取血2 mL置于试管中，血液凝固后分离血清，保存于-20℃冰箱备用。同时迅速在距离肛门8 cm处剪取病变结肠组织1 cm×1 cm，生理盐水冲洗，固定于体积分数为10%的中性缓冲福尔马林液24 h，常规脱水，石蜡包埋、切片，苏木素—伊红（HE）染色备用。

1.7 指标检测

1.7.1 疾病活动指数（disease activity index，DAI）评分 参照Murano等[10]制定的方法，DAI=（体质量下降分数+便血分数+大便性状分数）/3。

1.7.2 结肠黏膜组织大体观及病理学观察 大鼠处死后，取全结肠，生理盐水冲洗干净，肉眼下观察结肠黏膜的充血、水肿、糜烂、坏死、出血等情况。显微镜下观察结肠组织病理学变化情况，包括有无炎性细胞浸润、腺体结构是否完整、有无溃疡等情况。

1.7.3 采用ELISA法测定血清中IL-1β、IL-8含量具体操作按试剂盒说明进行。操作如下：采用抗人IL-1β/IL-8单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的IL-1β/IL-8与单抗结合，加入生物素化的抗人IL-1β/IL-8，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入酶底物OPD，出现黄色。加终止液硫酸，颜色变深，在492 nm处测光密度（D）值。IL-1β/IL-8浓度与D（492 nm）值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中IL-1β、IL-8浓度。

1.7.4 采用RT-PCR法检测结肠黏膜组织中NF-κB mRNA表达情况 具体操作：采用Trizol法提取结肠黏膜组织总RNA，使用分光光度计检测260/280 nm处总RNA浓度后，开始反转录。反转录反应体系为20 μL，具体操作参照RT试剂盒说明进行。PCR扩增反应体系20 μL，NF-κB上游引物为5’-CTACCCCGAAATCAA AGACAAG-3’，下游引物为5’-ACTCTTGGCACAATCTCTAGGC-3’。以β-actin为内参。PCR反应程序如下：95℃30 s预变性，40个循环，95℃5 s变性，59.7℃30 s退火，72℃30 s采集荧光。使用Sequence Delection Soft Wareversion 1.2.3软件分析PCR过程中样本的CT值。通过2-△△CT计算NF-κB mRNA相对表达水平（p）。

1.8 统计方法 采用SPSS 20.0软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(-x±s)表示，以均进行正态性和方差齐性检验。多组比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠DAI评分比较 表1结果显示：与正常组比较，UC模型组大鼠DAI评分升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与UC模型组比较，2个治疗组DAI评分显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与美沙拉嗪组比较，化浊解毒方组DAI评分明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 各组大鼠DAI评分比较Table 1 Comparison of DAI score in various groups (-x±s)

2.2 各组大鼠结肠黏膜组织大体观及病理学比较 图1结果显示：与正常组比较，各造模组大鼠结肠黏膜表面均有不同程度的充血、水肿、糜烂等表现。其中，UC模型组最为严重，黏膜可见糜烂、水肿，部分出现溃疡及坏死，镜下腺体排列紊乱，大量炎性细胞浸润。与UC模型组比较，2个治疗组大鼠结肠黏膜均有不同程度缓解，化浊解毒方组黏膜表现接近正常组，其表面较光滑，水肿、充血不明显，可见愈合的溃疡面，黏膜腺体结构完整，偶有少量炎性渗出。美沙拉嗪组大鼠结肠黏膜表面欠光滑，可见少量水肿、糜烂及表浅溃疡形成，黏膜腺体结构基本完整，可见部分炎性细胞浸润。

图1 各组大鼠结肠黏膜组织病理学观察（HE染色，×40）Figure 1 Comparison of pathological features of colonic mucosal tissues in various groups（by HE staining，×40）

2.3 各组大鼠血清中IL-1β、IL-8含量比较 表2结果显示：与正常组比较，UC模型组大鼠血清中IL-1β、IL-8含量显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与UC模型组比较，2个治疗组大鼠血清中IL-1β、IL-8含量均显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与美沙拉嗪组比较，化浊解毒方组血清中IL-1β、IL-8含量均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 各组大鼠结肠黏膜组织中NF-κB mRNA表达比较 表2结果显示：与正常组比较，UC模型组结肠黏膜组织NF-κB mRNA表达水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与UC模型组比较，2个治疗组大鼠结肠黏膜组织中NF-κB mRNA表达水平均显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与美沙拉嗪组比较，化浊解毒方组结肠黏膜组织中NF-κB mRNA表达水平明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 各组大鼠血清IL-1β、IL-8含量及结肠黏膜组织NF-κB mRNA表达水平比较Table 2 Comparison of the serum contents of IL-1β and IL-8，and colonic mucosal expression level of NF-κB mRNA in various groups (-x±s)

3 讨论

UC是一种病因及发病机制尚不完全明确的慢性非特异性炎症性肠病。现代研究多认为，免疫异常是UC发生发展中的关键环节，而细胞因子在介导异常免疫反应中起重要作用。IL-1β是一种由单核巨噬细胞产生的致炎因子，可以激活树突样细胞吞噬抗原，释放抗原片段，参与免疫反应的持续与放大[11]。同时IL-1β也可诱导单核细胞及中性粒细胞趋化，分泌白三烯等大量炎症物质，使肠道黏膜丧失上皮屏障功能，从而加重炎症反应[12]。IL-8是在内源性及外源性因子刺激下产生的一种多肽因子。IL-8具有趋化和激活中性粒细胞等炎性细胞的作用，增加过氧化物及溶酶体酶数量，增强自然杀伤细胞的细胞毒性，参与UC发病过程[13]。NF-κB作为一种具有多向转录调节作用的转录因子，广泛存在于各类组织中，主要参与免疫应答、炎症反应、组织修复等基因信息的表达[14]。研究发现，活化后的NF-κB能够结合细胞核基因的增强子或启动子，调节基因转录，激活相关细胞应激基因，产生如IL-1、IL-6、IL-8等细胞因子[15]。NF-κB在UC的发生发展中起到了枢纽作用[3]。

在我国传统医学中并没有UC病名记载，根据其临床表现，可以将本病归属为“久痢”、“痢疾”等范畴[16]。古代医家多认为素体脾虚为UC发病基础，饮食不节（洁）、情志失调皆为常见病因，病理性质属本虚标实。本课题组经过大量临床实践发现，“浊毒内蕴”是本病的主要病机。现代饮食偏于肥甘厚味，日久则脾胃不和，运化失司，水湿内停，气机阻滞，湿热蕴结，湿久则化浊，热久而蕴毒，浊毒内蕴，与气血搏结，损伤肠络，血肉腐败化脓。针对此病机，本课题组自拟化浊解毒方治疗UC。方中佩兰“辛平能散结滞，芬芳能除秽恶”（《本草经疏》），乃祛浊要药，与藿香合用共奏化浊辟秽之功。凤尾草、飞扬草清热利湿解毒，亦有收敛止痢之效。四药合用化浊解毒，直击病源。茵陈蒿、泽泻利湿清热，化浊解毒。现代药理研究表明，茵陈可参与机体免疫调节，同时对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等有不同程度的抑制作用。佛手、厚朴理气宽中，“调气则后重自除”。地榆苦寒，凉血止血、疗疮解毒，儿茶活血化瘀、收敛生肌，胡黄连清热凉血燥湿，仙鹤草收敛止血解毒，四药合用“行血则便脓自愈”。石榴皮、乌梅涩肠止泻，苍术健脾止痢，白芍行气和血，缓急止痛。诸药合用，化浊解毒，调气和血，诸症向愈。

本研究结果显示：经化浊解毒方治疗后，UC大鼠体质量、便血、粪便性状等一般情况均得到显著改善，镜下结肠黏膜恢复良好，血清中IL-1β、IL-8含量及结肠黏膜NF-κB mRNA表达水平显著降低。提示化浊解毒方可能是通过改善NF-κBmRNA表达，抑制相关炎症因子的表达，达到修复受损肠黏膜、治疗UC的目的。