促肾上腺皮质激素对不同黑素皮质素受体2基因型婴儿痉挛症疗效及高度失律缓解的影响研究

李宝广，李爱霞，杨花芳，郑华城，左月仙，刘兰，王欣，吴文娟，刘征燕

本研究背景及创新点：

婴儿痉挛症为婴幼儿期常见的癫痫综合征。痉挛发作、脑电图高度失律及精神发育迟滞为其典型的三联征表现。患儿通常对传统抗癫痫药物反应不敏感，痉挛发作不易控制，后期常会转型为其他癫痫综合征，大部分有严重的后遗症状。盲目治疗常会加重家庭负担并且造成大量社会资源的浪费。目前促肾上腺皮质激素（ACTH）作为其一线用药，有效率较高，但也仅有60%～80%，且该药为激素类制品，价格昂贵、治疗周期长（28 d），不良反应较大，时有药品短缺导致治疗中断。治疗前期预估其疗效显得尤为重要。本研究以痉挛发作的控制及高度失律是否缓解为指标，研究黑素皮质素受体2（MC2R）基因单核苷酸多态性对ACTH疗效的影响。发现ACTH对MC2R基因TCCT携带型痉挛发作控制率更高，提示早期对婴儿痉挛症进行单核苷酸多态性分析，可有效指导治疗，节省家庭和社会资源。婴儿痉挛症是婴幼儿期的一种灾难性癫痫，以痉挛发作，脑电图高度失律及精神发育迟滞为特点，其对传统抗癫痫药物反应不佳[1]。促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）作为婴儿痉挛症的首选用药，有效率较高，但也仅有60%～80%[2]。导致患儿对ACTH耐药的原因有多种，不同黑素皮质素受体2（melanocortin2-receptor，MC2R）基因型是其中原因之一[3]。本研究收集56例婴儿痉挛症的临床资料，分析ACTH对不同MC2R基因型婴儿痉挛症疗效及高度失律缓解的影响，进而指导临床治疗。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2016年10月—2018年10月在河北省儿童医院住院部行ACTH治疗且符合入组标准的婴儿痉挛症56例，患儿均来自不同家系。其中男36例，女20例，男女比例为1.8∶1。入组标准：符合2015年中国抗癫痫协会提出的癫痫及癫痫综合征分类诊断标准[4]。排除标准：（1）入组前曾给予激素或ACTH治疗；（2）入组前曾给予其他抗癫痫药物治疗；（3）颅脑CT和/或磁共振成像（MRI）检查有脑血管畸形、占位性病变或其他神经系统进行性病变；（4）存在心、肝、肾功能不全等其他不能耐受ACTH治疗的情况。患儿家属均签订知情同意书，本研究经本院伦理委员会批准。

1.2 方法 所有患儿建立档案，详细记录病史，进行体格检查、视频脑电图、基因全外显子检查等。

1.2.1 体格检查及康复评估 记录患儿性别、心、肺、肾、肝等一般查体情况；记录起病年龄、使用ACTH前病程、智力运动发育落后情况；记录母亲妊娠年龄、孕周、孕产次情况。

1.2.2 视频脑电图检查 应用日本光电工业株式会社生产型号EEG-1200C的数字化视频脑电图仪。按国际10～20系统安放16导联记录电极，双侧耳电极为参考电极。对患儿进行4 h的临床监测和脑电图记录，必要时延长监测时间，多数患儿在检查前进行适当的睡眠剥夺，描记包括清醒、睁闭眼（被动闭眼）和睡眠。患儿在行ACTH治疗之前行视频脑电图检查，并于ACTH治疗第28天结束后复查视频脑电图。记录有无高度失律。

高度失律判定标准：弥漫性不规则中-高波幅混合波上夹杂大量杂乱多灶性棘波、尖波，左右不对称，不同步，完全失去正常脑电图节律，棘波、尖波和慢波多数无固定的组合关系，即不形成真正的棘（尖）慢复合波[5]。高度失律改善判定标准参考文献[6]。

1.2.3 基因全外显子检查 采集患儿及父母静脉血2 ml（EDTA抗凝），按DNA抽提试剂盒（迈基诺公司，中国）说明书提取基因组DNA。利用新一代高通量测序法（迈基诺，中国）检测患儿可能致病基因，同时检测MC2R基因。根据MC2R基因启动子区4个单核苷酸多态性（SNP）构成的单体型类型分为TCCT携带组即TCCT/TCCT或TCCT/0，TCCT非携带组即0/0型。

1.3 治疗方法 所有入组患儿给予ACTH（规格：25 U/瓶，上海上药第一生化药业有限公司生产，药品批号：1610601）治疗，初始3 d 1 U/kg，若无明显不良反应加量至2 U/kg，最大量不超过25 U，连续治疗28 d。观察发作控制情况。疗效判定：发作完全控制或发作减少50%以上记录为有效，发作减少50%以下记录为无效[7]。

1.4 统计学方法 采用SPSS 18.0软件进行统计学分析。计量资料符合正态分布以（±s）表示，两组间比较采用成组t检验；计数资料比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况比较 TCCT携带组与TCCT非携带组性别、起病年龄、使用ACTH前病程、智力运动发育落后情况、母亲妊娠年龄、母亲孕周、母亲孕产次比较，差异均无统计学意义（P＞0.05，见表1）。

2.2 疗效比较 治疗28 d后，TCCT携带组有效36例，无效10例，有效率为78.2%；TCCT非携带组有效3例，无效7例，有效率为3/10。两组有效率比较，差异有统计学意义（χ2=9.26，P＜0.05）。

2.3 高度失律缓解率比较 视频脑电图高度失律检出率为43例，占76.8%（43/56），TCCT携带组36例，治疗28 d后，缓解24例，未缓解12例，缓解率为66.7%；TCCT非携带组7例，治疗28 d后，缓解3例，未缓解4例，缓解率为3/7。两组高度失律缓解率比较，差异无统计学意义（χ2=1.46，P＞0.05）。

3 讨论

婴儿痉挛症的发病机制尚不清楚[8]。目前有多种假说，如脑干功能障碍、分娩前应激暴露假说、下丘脑-垂体-肾上腺素（HPA）轴功能失调、脑发育不同步理论、5-羟色胺假说、N-甲基-D-天冬氨酸受体假说、皮质-皮质下脑组织间的调节障碍、免疫功能失调、基因变异等[9]。鉴于以上病因，多种婴儿痉挛症模型被建立，如：多重打击模型、促肾上腺皮质激素释放激素（corticotropin releasing hormone，CRH）模型、N-甲基-D-天冬氨酸受体模型、γ-氨基丁酸（GABA）受体激动剂/Ts65Dn小鼠模型、河豚毒素模型、ARX模型等[10]。但目前为止没有一种假说能完全解释该病的所有临床特征，没有一种因素与所有患儿有绝对的因果关系。尽管病因多种多样，但其临床均表现为痉挛发作，脑电图多表现为高度失律，以上的相似性提示婴儿痉挛症可能是由脑内特定部位或具有特定功能一群神经元发育异常所致。进而出现了影响较大的“共同兴奋途径”假说[11]：导致婴儿痉挛的所有病因激活了大脑本身的“应激系统”，增加了边缘系统中应急活化的神经肽和CRH的合成和释放，而边缘系统的病理生理变化易导致癫痫。即痉挛发作的可能触发因素为CRH分泌或者激活过多。

CRH是由41个氨基酸组成的神经肽。传统观念认为其主要表达在下丘脑，随着相关领域的发展，研究发现CRH在脑内分布广泛，包括梨状区、终纹床核、杏仁核、下丘脑室旁核、巴林顿核、下橄榄核、脑桥灰质区、网状核、楔束核、丘脑中核[12]。CRH在大脑主要有两个受体CRHR1和CRHR2。CRH对CRHR1的亲和性比CRHR2高，故CRHR1是CRH发挥效应的重要受体。CRH与CRHR1结合后调节HPA轴的功能，也可调节应激、再生、免疫反应及肥胖相关分子[13]，并且与学习、记忆[14]、嗅觉[15]、精神性疾病[16]、内分泌疾病如子宫内膜异位症[17]等相关。CRH诱导不成熟脑惊厥作用可能由CRHR1介导[18]，研究显示选择性阻断CRHR1可阻止CRH诱导的不成熟大鼠的癫痫发作[19]；这种现象具有年龄依赖性，如出生14 d左右的大鼠比成年大鼠高200多倍[20-21]，国内研究证实动物痉挛模型产前不良应激水平更高，提示母体分娩前应激水平与痉挛发生率呈正相关[22]。总之，婴儿痉挛症潜在病因使脑内应激系统过度激活，大脑的杏仁核区、下丘脑、海马等可迅速表达CRH基因，使其释放增加，激活突触后的CRH受体后，较少量的谷氨酸信号即可被放大为强大的兴奋性信号，产生癫痫放电，引起癫痫发作。

虽ACTH治疗婴儿痉挛症的机制尚不十分清楚，但主流观点认为ACTH或其下游的糖皮质激素可负反馈抑制CRH在杏仁核神经元的表达，从而达到治疗目的[23]。另有研究表明，ACTH通过增加糖含量，诱导髓鞘和树突形成，进而促进脑成熟，缩短易损期；并且ACTH可以作为神经调节因子及神经递质作用影响神经系统发育，对抗惊厥[24]。国外研究表明，除抗惊厥外，ACTH还可以改善学习记忆功能[25]，对注意力缺陷也有治疗作用[26]。

目前ACTH是婴儿痉挛症最为有效的治疗药物。研究表明黑素皮质素受体（MCR）SNP可影响ACTH治疗的反应性，且不同基因型之间婴儿痉挛症发病率也存在差异[3]。近期已发现MCR有5种：MC1R、MC2R、MC3R、MC4R、MC5R。MC1R与皮肤和毛发颜色有关[27]；MC2R主要分布在肾上腺皮质，与HPA轴下游作用相关[28]；MC3R主要存在于边缘叶系统，可能与学习和记忆有关[29]；MC4R分布在海马、丘脑、下丘脑、脑干及脊髓等部位，影响饮食和体质量调节[30]；MC5R主要分布于与外分泌功能调节相关的多种腺体组织[31]。MCR基因编码重要功能区的SNP可以影响MCR的分子构象、表达水平、与配体的结合效率等，进而影响ACTH治疗效果。

表1 TCCT携带组与TCCT非携带组患儿一般情况比较Table1 Comparison of general condition and clinical indices between TCCT carrying group and TCCT non-carrying group

MC2R启动子区有4个SNP构建的4-SNP单体型，其人群中分布有3种类型，分别是纯合子（TCCT/TCCT）、杂合子（TCCT/0）、非携带（0/0）。前两者合称为TCCT携带型，后者称为TCCT非携带型。本研究结果显示，TCCT携带组ACTH治疗有效率较TCCT非携带组更高。研究表明其机制可能为：TCCT单体型跨越影响ACTH疗效发挥的CREs区域，可以明显提高MC2R启动子的转录效率，并且经ACTH刺激后，MC2R转录效率及mRNA表达明显上调[32]。本研究就痉挛发作的控制而言，与国内报道[3]一致。两组在高度失律缓解率方面无差异，可能与样本量过少有关。另外婴儿痉挛症患儿中TCCT携带组占比较高，这是否与人群中TCCT非携带型占比较少有关，再者TCCT携带与否与患婴儿痉挛症的概率高低有无关系，需进一步研究。

MC2R通过与ACTH配体结合，可通过与其亲和力大小影响ACTH发挥效应，进而参与疾病的发生和治疗。本研究表明婴儿痉挛症患儿中MC2R启动子区TCCT SNP直接影响了ACTH的治疗效果。本研究向婴儿痉挛症的精准治疗迈出一步，进而减少该病引起的社会和家庭负担。

综上所述，本研究提示在婴儿痉挛症的治疗过程中，MC2R基因SNP意义重大，TCCH携带型比TCCH非携带型对ACTH治疗反应性更高。提示在婴儿痉挛症诊治早期可行MC2R基因SNP分析，以更好、更快地判断疗效。本研究不足之处为样本量较小，TCCT非携带组仅10例，对统计学结果的准确性产生影响；为单中心研究；疗效判断过于主观，缺乏客观评价指标。未来需行多中心、大数据、标准化研究，并对MC2R对ACTH剂量及有效治疗反应时间有无影响等方面进行深入研究。

作者贡献：李宝广进行文章的构思与设计，撰写论文；杨花芳进行研究的实施与可行性分析；刘兰、王欣进行数据收集；刘征燕进行数据整理；吴文娟进行统计学处理；郑华城进行结果的分析与解释；左月仙进行论文的修订；李宝广、李爱霞负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。