乙酰辅酶A合成酶2低表达人胃癌细胞株MGC80-3的顺铂敏感性观察

糜磊，武丹，陶清，周月鹏，陈德玉

(江苏大学附属医院，江苏镇江212001)

胃癌化疗抵抗形成的原因之一在于肿瘤细胞较强的凋亡抵抗能力，导致化疗效果减弱以及失败后的再增殖、转移和复发等进程[1]。已有研究[2～4]证实，在多种肿瘤细胞中乙酰辅酶A合成酶2(ACSS2)可通过将乙酸盐、辅酶A以及三磷酸腺苷(ATP)等生成乙酰辅酶A，参与肿瘤的生长、侵袭、转移等。但在不同研究[5，6]中ACSS2表达强度对肿瘤预后以及治疗拮抗的影响尚存在较大争议。核因子κB(NF-κB)即p65，它的激活形式是磷酸化后形成p-p65，当前众多研究指出，作为抗凋亡转录因子，它的激活会诱导许多抗凋亡因子产生，比如B淋巴细胞瘤-2蛋白(Bcl-2)、B细胞淋巴瘤-特大型蛋白(Bcl-xL)[7, 8]，同时也会下调凋亡蛋白Bcl-2相关的X蛋白(Bax)的表达[9]。我们观察了ACSS2低表达的人胃癌细胞株MGC80-3顺铂(DPP)敏感性，旨在揭示ACSS2在胃癌DDP抵抗效应形成的具体作用。

1 材料与方法

1.1 ACSS2、细胞及试剂 ACSS2购自美国Santa Cruz Biotechnology公司，人胃癌细胞株MGC80-3、AGS、SGC-7901、NCI-N87以及正常胃黏膜上皮细胞系RGM-1购自于上海吉凯基因化学技术有限公司， 均用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基在37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。转染细胞所用NC及siRNA-ACSS2购于上海吉玛制药技术有限公司，转染siRNA均为标准步骤，siRNA-ACSS2正义链5′-UAUGCUUGGUGACAGGCUCAUCUCC-3′；反义链5′-GGAGAUGAGCCUGUCACCAAGCAUA-3′；NC：正义链5′-GCGACGAUCUGCCUAAGAUdTdT-3′；反义链5′-AUCUUAGGCAGAUCGUCGCdTdT-3′。RPMI1640培养基及胎牛血清购自美国Gibco公司，DPP购自上海Selleck公司，CCK-8试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司，Bcl-2、Bcl-xL、Bax、p65、p-p65以及β-Actin单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.2 MGC80-3、AGS、SGC-7901、NCI-N87及RGM-1细胞ACSS2蛋白检测 采用Western blotting法。取对数生长期MGC80-3、AGS、SGC-7901、NCI-N87及RGM-1细胞，离心测定蛋白浓度后加入上样缓冲液，煮沸10 min变性处理。经聚丙烯酰胺SDS凝胶电泳后，将蛋白电转移至PVDF膜上，封闭60～90 min后置于稀释好的ACSS2(1∶1 000配置)抗体稀释液中4 ℃冰箱孵育过夜；再次洗涤后加入抗鼠或抗兔HRP标记二抗室温孵育60 min，清洗加入曝光液显影、拍摄并利用蓝翔化学分析软件分别测定目的蛋白及β-Actin的灰度值，目的蛋白与对应β-Actin灰度值之比即为目的蛋白的相对表达量，重复3次，取平均值。

1.3 MGC80-3细胞分组、siRNA转染及DDP给药方法 对数生长期MGC80-3细胞分为A、B、C、D组，B及D组分别进行转染小干扰RNA(siRNA)实验，加入10 μL脂质体Lipofectamine 2000+5 μL siRNA-ACSS2转染， C组加入及A组分别加入50 μL无血清纯RPMI1640培养基+5 μL 阴性对照(NC)；A、B组均培养72 h，C组培养48 h时加入5 μg/mL的DDP继续处理24 h，D组转染48 h时加入5 μg/mL的DDP继续处理24 h。

1.4 各组MGC80-3细胞增殖活力检测 采用CCK8法。取各组细胞，每组6个复孔，每孔加入10 μL的CCK8，震荡、孵育1～2 h后在酶联检测仪450 nm 波长下检测各组OD值，按细胞增殖活力(%)=(OD处理组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)×100%公式计算细胞相对活力。OD处理组为B、C组孔的OD值；OD空白组为只含培养基和CCK8溶液而无细胞的孔的OD值；OD对照组为A、D组孔的OD值。

1.5 各组凋亡MGC80-3细胞检测 采用流式细胞分析术。取各组细胞，用不含EDTA胰酶消化离心后用预冷的PBS洗2次，每管用500 μL标记缓冲液重悬，避光下先加入5 μL的Annexin V-FITC，待临上机前15 min加入10 μL PI，用流式细胞仪观察各组细胞凋亡情况。

1.6 各组细胞ACSS2、p65、p-p65、Bcl-2、Bcl-xL、Bax蛋白检测 采用Western blotting法。取各组细胞，所有操作均同“1.2”，重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 MGC80-3、AGS、SGC-7901、NCI-N87及RGM-1细胞ACSS2蛋白相对表达量比较 MGC80-3、AGS、SGC-7901、NCI-N87及RGM-1细胞ACSS2蛋白相对表达量分别为0.80±0.03、0.62±0.04、0.60±0.04、0.72±0.05、0.41±0.04。与RGM-1细胞比较，MGC80-3、AGS、SGC-7901、NCI-N87细胞ACSS2相对表达量升高(P均<0.01)；MGC80-3细胞ACSS2相对表达量比其余胃癌细胞高，因此后续实验选择MGC80-3细胞进行。

2.2 各组细胞增殖活力比较 A、B、C、D组细胞增殖活力分别为98.67%±4.89%、92.67%±7.86%、62.67%±4.05%、34.67%±7.61%，A组与B组相比无明显差异(P>0.05)；与A组比较，C组细胞增殖活力下降(P<0.001)；与B、C组比较，D组细胞增殖活力均下降(P均<0.001)。

2.3 各组细胞凋亡情况比较 A、B、C、D组早期细胞凋亡率分别为1.06%±0.02%、1.13%±0.08%、7.62%±0.55%、14.33%±0.21%，晚期细胞凋亡率分别为8.01%±0.05%、8.13%±0.06%、10.81%±0.43%、15.98±0.18%。与A组比较，C、D组细胞早、晚期凋亡率均升高(P均<0.05)；与B组比较，D组早、晚期凋亡率均升高(P均<0.05)；与C组比较，D组细胞早、晚期凋亡率均升高(P均<0.05)。

2.4 各组细胞ACSS2、p65、p-p65、Bcl-2、Bcl-xL、Bax蛋白相对表达量比较 见表1。与A组比较，C组p-p65、Bax蛋白相对表达量升高，Bcl-2、Bcl-xL相对表达量降低(P均<0.05)；与B组比较，D组细胞p65、p-p65、Bcl-2、Bcl-xL相对表达量均降低、Bax相对表达量升高(P均<0.05)。

表1 各组MGC80-3细胞ACSS2、p65、p-p65、Bcl-2、Bcl-xL、Bax蛋白相对表达量比较

3 讨论

胃癌目前以手术、放疗及化疗的综合治疗为主要干预手段，但受限于早期转移、治疗拮抗等因素，5年生存率仅在15%～30%[1, 2, 10, 11]。化疗在胃癌综合治疗方案中有着至关重要的作用，其中DPP作为常见一线治疗用药而被广泛应用，然而抵抗效应的产生造成治疗失败也制约了化疗药物在临床的使用。

ACSS2是一种将乙酸盐转化为乙酰辅酶A的代谢酶，直接参与到细胞能量代谢以及物质转化，同时因其可以影响组蛋白乙酰化进程进而可以发挥表观遗传学修饰，调控细胞特别是肿瘤细胞的多种生物学行为：肾癌组织中ACSS2表达强度要远高于癌旁正常组织，同时肾癌细胞通过促进LAMP1蛋白表达促进侵袭、转移发生[5]；在肿瘤细胞中ACSS2调控乙酸盐摄取和利用进而参与脂质合成以及组蛋白乙酰化等进程[12]；在肿瘤特定微环境下如低氧、脂质缺乏等条件下，肿瘤细胞通过激活ACSS2表达来维持其增殖活力[13]；在膀胱癌中ACSS2可能通过参与脂质代谢最终影响顺铂耐药形成，可以作为潜在预后判断的标记[3, 4]。因此探讨ACSS2在胃癌化疗敏感性中的作用、相关机制并寻找可以逆转耐药形成的潜在靶点，显然对有效提高治疗效果和患者生存率具有重要的临床价值。

本研究结果发现，胃癌细胞株中ACSS2的表达强度更高，可见其在胃癌细胞中担负着十分重要的作用。通过CCK8及流式细胞学分析发现干扰ACSS2表达之后对细胞增殖及凋亡情况无明显影响，但结合顺铂处理后发现，干扰ACSS2表达会导致胃癌细胞增殖活力明显下降，并且凋亡率显著升高。结合上述不同类型肿瘤中ACSS2的作用，我们猜测胃癌细胞中ACSS2表达可能参与化疗敏感性调节。胃癌细胞中靶向下调ACSS2表达可以抑制p-p65的形成，NF-κB作为核转录因子，在信号转导过程中其活化形式p-p65的形成、转位参与到胃癌细胞增殖、转移、治疗拮抗等多个生物学效应[1, 14]。已有研究[10,11]发现，当胃癌细胞高表达抗凋亡蛋白如Bcl-2、Bcl-xL等，抑制促凋亡相关蛋白如Bax生成时，可对顺铂、紫杉醇等化疗药物产生抵抗效应，而这一进程涉及到复杂的分子相互作用。在本实验中通过干扰ACSS2表达而抑制p-p65形成的同时Bcl-2蛋白表达量也出现了下调， 结合顺铂处理后，进一步证实siRNA-ACSS2处理促进了促凋亡蛋白Bax的生成。

综上所述， 人胃癌细胞株ACSS2高表达。ACSS2低表达的MGC80-3细胞DDP敏感性升高。ACSS2可能通过调控NF-κB信号通路及Bcl-2、Bcl-xL、Bax蛋白的表达提高MGC80-3细胞的DDP敏感性。ACSS2可能通过参与NF-κB活化及下游凋亡相关蛋白表达来调控胃癌细胞DDP敏感性，但其具体作用机制尚有待于进一步研究。