TGF-β1及其抑制剂培养的子宫内膜异位症患者异位子宫内膜间质细胞增殖、侵袭情况观察

于克，王祝荣

(扬州大学附属医院，江苏扬州225000)

子宫内膜异位症(Endometriosis, EMs)是一种雌激素依赖性的妇科疾病，其特征在于子宫内膜组织异位于子宫腔外，最常见于盆腔腹膜和卵巢，随激素水平发生月经周期变化[1]。10%左右的育龄妇女患有EMs，其中30%左右患者无临床症状，40%左右患者不孕，其余患者常见痛经、慢性盆腔疼痛。EMs是一种慢性疾病，可导致盆腔疼痛、不孕症和反复手术等严重并发症，严重降低患者生活质量和增加患者经济负担。异位子宫内膜组织转变为恶性组织的风险较高，手术治疗可以缓解EMs患者的疼痛，但75%的患者术后2年内即症状复发，激素干预治疗后不良反应较严重[2，3]。EMs的病因、发病机制和病理生理学目前仍尚未完全了解，因此研究EMs发病的分子机制对指导临床治疗具有重要意义。Wnt/β-catenin通路是调控细胞增殖、侵袭转移的重要信号通路之一，β-连环蛋白(β-catenin)是Wnt/β-catenin信号通路中的枢纽，β-catenin的靶基因之一是cMYC原癌基因。转化生长因子β1(Transforming Growth Factor beta1, TGF-β1) 是一种必需的生长因子，负责调节细胞增殖、分化、血管生成和免疫反应[4，5]。研究[6]发现，EMs患者异位子宫内膜组织TGF-β1高表达，在EMs的发生、发展中发挥关键作用。但TGF-β1在EMs发生、发展中的具体作用机制仍未完全明确。2017年6月～2018年12月，我们观察了EMs患者异位子宫内膜组织TGF-β1mRNA的表达变化，观察加入TGF-β1及其抑制剂培养的 ESCs细胞增殖、侵袭能力变化，并探讨其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 cDNA反转录、qRT-PCR试剂盒等均购自日本TaKaRa公司；TGF-β1、内参GAPDH引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；IV型胶原酶、DNA酶、波形蛋白、角蛋白抗体和免疫荧光二抗购自美国Sigma公司；Triton X-100、DAPI和抗荧光淬灭封片剂购自上海碧云天生物技术有限公司；DMEM / F12培养基和FBS购自美国Gibco公司； TGF-β1因子购自美国Peprotech公司；TGF-β1抑制剂Ly364947购自美国Abmole公司；MTS试剂盒均购自南京凯基生物技术有限公司；boyden基质胶购自美国BD公司；Transwell小室、96孔板、培养瓶等购自美国Coring公司；RIPA蛋白裂解液及BCA检测蛋白浓度试剂盒均购自美国Thermo公司；cMYC、β-catenin和GAPDH抗体均购自英国Abcam公司。

1.2 EMs患者异位子宫内膜组织、正常子宫内膜组织TGF-β1mRNA检测 收集2015年1月～2018年12月入住我院进行手术治疗的EMs患者手术切除EMs标本100例份，患者术前未接受激素或GnRH-α激动剂治疗。另取同一时期未患有EMs但因子宫腺瘤等良性疾病来我院治疗获得的正常子宫内膜组织40例份作为对照。将组织标本冷冻于-80 ℃。所有患者签署知情同意书，根据赫尔辛基宣言和我院伦理进行上述操作。

采用 qRT-PCR法检测TGF-β1mRNA。TRIzol完全裂解组织或细胞，采用异丙醇方法提取总RNA，测取RNA浓度，逆转为cDNA。设计合成TGF-β1上游引物为5′-ATCCATGTGTGACCATGAGGAAATG-3′,下游引物5′- TCGGCTAGTTAGGGTACACTTC-3′。内参GAPDH上游引物 5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′, 下游引物5′-GCCCAATACGACCAAATCC- 3′。以cDNA作为模板进行以95 ℃预变性5 s，95 ℃变性5 s、60 ℃退火30 s，共40个循环。以2-ΔΔCt代表TGF-β1mRNA的相对表达量，重复3次，取平均值。

1.3 ESCs分离、培养和鉴定 取异位子宫内膜新鲜组织，无菌生理盐水将子宫异位内膜组织中血液洗去后，将组织剪成碎块置于含2 mg/mL Ⅳ型胶原酶和100 μg/ mL的DNA酶中消化组织，37 ℃以100 rpm摇动60 min，70 μm孔径无菌尼龙网过滤未消化组织，将过滤的细胞在烧瓶中附着30 min，用PBS洗去血细胞、组织碎片和上皮细胞，将ESCs接种在含有10% FBS的DMEM / F12培养基中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

取对数生长期的ESCs以1×105细胞接种于6孔板中的细胞爬片上，细胞融合度为95%左右时，免疫荧光染色法鉴定ESCs。荧光显微镜下可见可见培养的ESCs细胞形态呈长梭形，符合ESCs的形态特征，培养的ESCs细胞几乎全部表达ESCs阳性标记物波形蛋白(vimentin)蛋白，几乎不表达ESCs阴性对照的上皮细胞标记物角蛋白(keratin)，表明本研究中培养的ESCs符合要求可进行后续研究。

1.4 ESCs细胞分组及TGF-β1处理 取对数生长期ESCs以每孔1×105细胞接种于6孔培养板中，分为1、2、3、4组，每组6个复孔。待细胞贴壁后1、2组分别加入终浓度为2 ng/mL的TGF-β1因子、4 μL PBS(TGF-β1因子配制溶剂),3、4组分别加入终浓度为1 μmol/L的Ly364947、2 μL的DMSO(Ly364947配制溶剂)，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

1.5 各组细胞TGF-β1mRNA检测 采用 qRT-PCR法检测各组细胞TGF-β1mRNA。取培养48 h时各组细胞，所有操作均同“1.2”，重复3次，取平均值。

1.6 各组细胞增殖情况观察 采用MTS法。取对数生长起各组细胞，每孔2 000个细胞接种于6孔培养板中，37 ℃培养箱中培养，分别于培养0、24、48、72 h时弃掉培养基，每孔加入100 μL MTS试剂(MTS试剂:培养基=1∶5)放置细胞培养箱中孵育2 h，采用全波长扫描仪测取样品490 nm处的光密度OD值。以OD值代表细胞的增殖能力。重复3次，取平均值。

1.7 各组细胞侵袭能力检测 采用Boyden实验。培养48 h时取各组细胞，无血清DMEM/F12培养基洗3次后计数，以5×104个细胞接种于Transwell小室聚碳酸酯微孔膜的BD基质胶上，下室加10% FBS的DMEM / F12培养基500 μL作为趋化因子，放至培养箱中培养，显微镜下观察细胞穿过情况，PBS洗聚碳酸酯微孔膜3次后甲醇固定10 min，结晶紫染色，显微镜下随机计数3个视野穿过的细胞，其均值代表细胞侵袭能力。重复3次，取平均值。

1.8 各组细胞β-catenin、cMYC蛋白检测 采用Western blotting法。培养48 h时取各组细胞，PBS洗3次后，加入RIPA蛋白裂解液将细胞斑块吹散，超声冰上裂解30 min，14 000 r/min、4 ℃离心30 min去除细胞碎片，上清移至新的EP管中，即为蛋白裂解液，测定蛋白浓度后加入loading试剂，煮沸变性进行蛋白上样，SDS-PAGE电泳分离蛋白，湿转，5%BSA室温封闭2 h，加入一抗稀释液4 ℃孵育过夜，TBST洗3次后，室温孵育二抗1 h，ELC化学发光法显示条带。以目的蛋白灰度值表示目的蛋白的相对表达量。重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 EMs患者异位子宫内膜组织、正常子宫内膜组织TGF-β1mRNA相对表达量比较 EMs患者异位子宫内膜组织、正常子宫内膜组织TGF-β1mRNA相对表达量分别为2.26±0.96、1.02±0.38(t=7.908,P<0.05)。

2.2 各组细胞TGF-β1mRNA相对表达量比较 培养48 h时1、2组细胞TGF-β1mRNA相对表达量分别为8.88±1.03、1.00±0.02(P<0.05);培养48 h时3、4组细胞TGF-β1mRNA相对表达量分别为0.57±0.07、1.00±0.04(P<0.05)。

2.3 不同培养时间各组细胞OD值比较 培养0、24、48、72 h时各组细胞OD值比较见表1。

表1 培养0、24、48、72 h时各组细胞OD值比较

注：与2组比较，*P<0.05；与4组比较，#P<0.05。

2.4 各组细胞穿膜数比较 培养48 h时1、2组细胞穿膜数分别为73.98±10.32、50.67±8.94(P<0.05);培养48 h时3、4组细胞穿膜数分别为28.04±7.99、53.17±10.52(P<0.05)。结果见图1。

图1 培养48 h时各组细胞穿膜情况

2.5 各组细胞β-catenin、cMYC相对表达量比较 培养48 h时各组细胞β-catenin、cMYC相对表达量比较见表2。

表2 培养48 h时各组细胞β-catenin、cMYC相对表达量比较

注：与2组比较，*P<0.05；与4组比较，#P<0.05。

3 讨论

EMs是一种常见的妇科慢性疾病，严重影响患者的生活质量，并导致患者不孕和具有恶性肿瘤高发高风险，是妇科疾病领域中的研究热点[1]。ESCs可逃避正常的免疫监视，侵袭迁移到子宫体以外的组织进行增殖，生成血管，形成异位的子宫内膜组织，目前EMs的发病机制尚未完全明确，其中包括逆行性月经、免疫功能紊乱、侵入性植入和子宫内膜组织的异位生长，月经逆行理论认为，月经期间子宫内膜组织的反流是异位子宫内膜的来源，是EMs发病机制中最为广泛接受的假说[7]。在EMs疾病的初始阶段，反流的子宫内膜组织与腹膜间皮的黏连附着是EMs病变形成的关键步骤，αvβ3、α4β1、VCAM-1和Nectin-4等黏附分子是促进子宫内膜与间皮组织附着黏附微环境的重要因素[8，9]，而大量研究[10]已经证实这些黏附分子受细胞生长因子的调节，但是这种调节的具体作用机制仍未明确，在EMs患者中已经报道了细胞生长因子在血清、腹膜液中的浓度显著增加。细胞生长因子可能是促进ESCs增殖侵袭的关键因素，因此研究细胞因子在EMs发病过程中的作用及可能的机制对EMs的治疗可能提供新的策略。

细胞生长因子是由细胞产生的传递细胞间信号的分子，参与组成细胞生长微环境，具有影响细胞的生长、细胞外基质的形成及血管生成等生理作用，在疾病的发生发展中也具有重要作用[11]，其中TGF-β家族是一种25 kDa的肽，做为重要的一类细胞生长因子受到学者的广泛关注。TGF-β抑制上皮细胞的生长，但是在多种恶性肿瘤组织中高表达[12]。众所周知肿瘤的恶性行为包括恶性增殖、高度侵袭和转移，而EMs在发病过程中同样具备侵袭增殖等恶性生物学行为，因此TGF-β可能促进EMs的发生发展。TGF-β包括三种亚型，不同亚型的表达模式与疾病进展的相关性不同，TGF-β1参与调控免疫监视、细胞黏附和腹膜侵入或植入细胞的生长，研究[10]报道TGF-β1被认为是EMs发病机制中的关键参与者，TGF-β1在EMs患者中的血清、腹膜液和囊肿组织中的表达均高于未患有无EMs的健康对照女性，在TGF-β1存在时子宫内膜细胞与腹膜粘附性升高[4]。Yu等[6]采用qRT-PCR和Western-blot检测40例EMs组织和40例正常对照子宫内膜组织中TGF-β1mRNA和蛋白的表达，结果显示与正常对照子宫内膜组织相比，TGF-β1在mRNA和蛋白水平均高表达于EMs组织中，本研究对入住我院100例EMs患者异位的子宫内膜组织和40例未患有EMs患者的正常子宫内膜组织中TGF-β1的表达情况进行了检测，qRT-PCR结果同样显示TGF-β1mRNA的表达水平在EMs患者异位的子宫内膜组织中的表达显著高于正常子宫内膜组织，与已有的报道研究结果一致，而TGF-β1在EMs发病过程中的作用及机制需进一步研究。

首先我们从新鲜的异位子宫内膜组织分离培养出原代ESCs，并对其进行鉴定，vimentin表达于间质细胞而keratin表达于上皮细胞，因此利用免疫荧光发现培养出的原代细胞中全部表达vimentin蛋白，而keratin蛋白几乎不表达，表明原代ESCs成功分离出，可进行后续的功能实验。在细胞培养基中加入TGF-β1因子可刺激细胞中TGF-β1的表达，本文采用2 ng/mL的TGF-β1因子处理ESCs，增加ESCs中TGF-β1表达后，MTS和Boyden实验结果显示ESCs增殖和侵袭能力增加。同时本文采用TGF-β1抑制剂Ly364947处理ESCs，抑制ESCs中TGF-β1的表达后，MTS和Boyden实验结果显示ESCs增殖和侵袭能力降低。以上结果表明TGF-β1促进ESCs的增殖和侵袭。李凤梅等[13]报道TGF-β1通过诱导代谢重组促进EMs患者ESCs的迁移和侵袭。ESCs异位病灶微环境中的Treg细胞分泌的TGF-β1可能通过活化ERK和p38信号通路激活Smad2信号通路促进EMs的发生发展[14]。TGF-β1调控ESCs增殖和侵袭的作用机制仍需进一步探讨，wnt/β-catenin通路是调控细胞增殖和侵袭转移的重要信号通路之一，该通路与多种妇科肿瘤疾病的发病进展以及预后转归等关系密切[15,16]，张星光等[17]通过在组织水平验证Wnt/β-catenin信号通路中相关蛋白在EMs异位子宫内膜组织中表达升高，得出Wnt/β-catenin信号通路影响EMs的迁移和侵袭，并且可能与术后疾病复发相关的结论。β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路中的枢纽[18]，β-catenin的靶基因之一cMYC是原癌基因，在细胞增殖和侵袭过程中均发挥重要功能[19]。本研究采用Western-blot检测发现在ESCs中促进TGF-β1的表达，β-catenin和cMYC蛋白的表达增加，而在ESCs中促进TGF-β1的表达，β-catenin和cMYC蛋白的表达减少，表明TGF-β1可以激活Wnt/β-catenin信号通路，但是更具体的作用机制需后续深入的研究。

综上所述，EMs患者异位子宫内膜组织TGF-β1mRNA表达升高。TGF-β1可能通过促进β-catenin、cMYC蛋白的表达，激活wnt/β-catenin信号通路，促进ESCs的增殖、侵袭。