鼻咽癌患者外周血中循环miR-31-5p表达及临床意义

易世江 熊伟明 栗子芳 凌月福 何晓松 刘鹏

1桂林医学院附属医院耳鼻咽喉-头颈外科（广西桂林541001）；2广西壮族自治区人民医院耳鼻咽喉-头颈外科（南宁530021）

鼻咽癌是我国南方地区一种常见的头颈部恶性肿瘤，病例类型以非角化性癌为主，放射治疗是其主要的治疗方法。虽然随着放疗技术的不断进步，鼻咽癌的5年生存率较前明显提高，但是仍有30%的患者出现局部复发及远处转移，也是导致治疗失败的主要原因。其中放疗抵抗是复发的主要因素［1-2］。microRNAs（miRNAs）是一类长约22 核苷酸的非编码单链RNA 分子，通过与目标基因的3′UTR 结合，在转录后水平调节基因表达［3］。miRNAs 是多种细胞生理过程的关键调控因子，包括增殖、分化、凋亡、存活、运动和形态发生。异常表达的miRNAs 存在于不同类型的肿瘤，参与肿瘤的发生发展与放化疗抵抗。在口腔、鼻咽部、喉部、唾液腺等解剖亚区头颈肿瘤中，miRNAs被认为是肿瘤分子标志物。而miR-31-5p 是众多miRNAs 分子中的一员，异常表达见于多种恶性肿瘤［4-5］。鼻咽癌中研究发现miR-31-5p 存在异常低表达，其低表达可以促进鼻咽癌的恶性生物学行为［6］。但有关外周血miR-31-5p 在鼻咽癌中的研究尚未见报道，因此本研究拟通过检测外周血中循环miR-31-5p 的表达，分析其在鼻咽癌患者与健康人中的表达有无差异，探讨miR-31-5p 与鼻咽癌患者临床病理参数和放疗的关系，为miR-31-5p 可能作为鼻咽癌新的肿瘤标志物及治疗靶点提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2015年2月至2016年10月桂林医学院附属医院收治的55 例鼻咽癌患者外周全血为观察组，男35 例，女20 例，年龄29～70 岁，平均（49.2 ± 10.8）岁；所有患者均为初治且经病理诊断明确，病理组织类型为未分化型非角化性癌，肿瘤TNM 分期标准采用AJCC 第7 版分期。另选取我院体检中心55 例经临床诊断无肿瘤相关疾病的健康体检者外周全血为正常对照组，男31 例，女24 例，年龄35～69 岁，平均（45.3 ±9.5）岁。本项研究通过我院伦理委员会批准，并同时签署患者知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 总RNA 提取和cDNA 合成 所有患者均采集静脉EDTA 抗凝血5 mL，对全血总RNA 提取采用TRI REAGENT BD（MRC GENE）试剂进行抽提。使用NanoDrop®ND-1000 测定RNA 浓度和纯度，OD260/280 值在1.8～2.1 之间为合格样品，经检测所有实验样品均合格。然后合成cDNA，首先备RT 混合反应液：2.5 mmol/L dNTP 混合液（dATP、dGTP、dCTP 和dTTP 各2.5 mmol/L）2 μL，10×RT 缓冲 液（250 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3，200 mmol/L KCl，40 mmol/L MgCl2，5 mmol/L DTT）2 μL，RT 特异引物（1 μmol/L）1 μL，Total RNA 200 ng，MMLV反转录酶（10 U/μL）2 μL，RNA 酶抑制剂（40 U/μL）0.3 μL，用无RNA 酶水将反应总体积补充至20 μL；然后在PCR扩增仪进行RT反应，16 ℃孵育30 min，42 ℃孵育42 min，85 ℃孵育5 min，反应结束后立即将产物取出，置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 qRT-PCR 检测 实时荧光定量PCR 反应按照以下说明进行操作。将所有cDNA 样品分别配置Realtime PCR 反应体系，体系配置如下：2×Master Mix 5 μL，10 μmol/L PCR 特异引物F 0.5 μL，10 μmol/L 的PCR 特异引物R 0.5 μL，加水至总体积为8 μL，轻弹管底将溶液混合，5 000 r/min 短暂离心；将8 μL 混合液加到384-PCR 板对应的每个孔中，再加入对应的2 μL cDNA。粘上封口膜，并短暂离心混合，将上述384-PCR 板置于Realtime PCR 仪上进行PCR 反应，每个样品设置3 个复孔，反应条件为：先预变性95 ℃，10 min；然后变性95 ℃，10 s；退火/延伸60 ℃，1 min，共扩增40 个循环；为了建立PCR 产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按95 ℃，10 s；60 ℃，60 s；95 ℃，15 s，并从60 ℃缓慢加热到99 ℃。以U6 为内参对照，根据qPCR 曲线得到循环数CT 值，miR-31-5p 的相对表达量用2-△△CT表示。以上所有步骤按照上海康成生物公司的相关操作说明进行，PCR 引物由上海英骏生物公司合成，引物序列：U6 F：5′GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT3′，R：5′CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3′。miR-31-5p SP：5′GGAGGCAAGATGCTGGC3′，R：5′GTGCGTGTCGTGGAGTCG3′。

1.3 分组标准 同期放化疗结束后3 个月内无局部残留或1年内无复发定义为放疗敏感组，而放疗后3 个月内有局部残留或1年内复发定义为放疗抵抗组，即将患者分为放疗抵抗和放疗敏感两组［7］。

1.4 统计学方法 运用SPSS 13.0 软件对数据进行统计分析。计量资料采用均数±标准差（x ± s）表示，两组间比较采用t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 鼻咽癌患者与健康对照组外周血中miR-31-5p 的表达 各组提取的总RNA 纯度均符合实验要求，经溶解曲线发现为单一峰，跑胶验证为目的条带。检测鼻咽癌患者外周血miR-31-5p 相对表达量为（0.658±0.217），明显低于正常对照组的相对表达量（0.976 ± 0.242），差异具有统计学意义（t=-7.216，P＜0.001）。

2.2 miR-31-5p 表达与临床病理特征的相关性分析不同病理分期的鼻咽癌患者外周血中miR-31-5p 的表达水平，发现miR-31-5p 的表达水平与肿瘤的T 分期、局部有无淋巴结转移关系密切（P＜0.05）。但是，与鼻咽癌患者的年龄、性别、是否远处转移不具有相关性（P＞0.05）。见表1。

2.3 miR-31-5p 表达水平与放疗 随访1年后，将55 例患者按标准纳入分组。其中，鼻咽癌放疗抵抗患者17 例（30.9%），鼻咽癌放疗敏感患者38 例（69.1%）。外周血miR-31-5p 相对表达水平分别为（0.529 ± 0.146）和（0.685 ± 0.245），两组比较差异具有统计学意义（t=-2.906，P=0.006）。

3 讨论

miRNAs 是一类保守、长约18～22 nt 的非编码RNA 分子，可作为肿瘤抑制因子或癌基因在转录后水平调节基因表达。研究［8-9］显示miRNAs 调控人类基因组中超过30%的基因表达，此类基因与细胞增殖、分化、代谢以及器官形成相关。异常表达的miRNAs 存在于不同类型的肿瘤组织及细胞系中，参与肿瘤的发生发展［10］。

表1 鼻咽患者miR-31-5p 的表达与临床参数的关系Tab.1 Association between miR-31-5p expression and clinicopathological features in NPC patients x±s

越来越多研究发现miRNAs 可作为肿瘤早期诊断及预后评估的潜在分子标志物［11］。但是这些研究主要是基于活检组织，具有一定的局限性，因为并不是所有部位的肿瘤都能获得足够的组织样本去病理分析，尤其是早期肿瘤［12］。近几年研究显示血清miRNAs 可作为直肠癌、肝癌、胰腺癌等肿瘤诊断和预后的分子标记物，相对于组织内检测，其具有无创、简便、易于操作的优点［13］，因此循环miRNAs 有望作为一种肿瘤标志物用于指导癌症的诊断和治疗，为肿瘤的监控及预测复发提供了一种新途径。

miR-31-5p 在直肠癌、肺癌等中过表达，而在胃癌、前列癌、乳腺癌等低表达［14］。ZHAO 等［15］研究表明，与正常肝细胞肝癌细胞系相比，miR-31-5p在肝细胞癌（HCC）细胞系中下调。并且miR-31-5p 过表达可靶向结合并抑制特异性蛋白1（SP1），诱导HCC 细胞生长、迁移、侵袭和细胞周期阻滞。ITO 等［16］报道miRNA-31-5p 可 能 调节BRAF 的 活化，并在结直肠癌EGFR 下游的信号通路中发挥作用。进一步研究显示，在鼻咽癌组织及细胞系中检测发现存在miR-31-5p 的低表达，miR-31-5p 是鼻咽癌重要的肿瘤抑制miRNA。miR-31-5p 可通过直接调控缺氧诱导因子1（FIH1）和微小体维持蛋白2（MCM2）降低鼻咽癌细胞生长［17］。另外，WU 等［18］首次使用非病毒小圆环载体（a non-viral minicircle vector）靶向结合miR-31-5p 影响其表达，证明了minicircle-orip-miR-31 可以作为一种新治疗鼻咽癌的靶向miRNA。这些数据进一步阐明了miR-31-5p 可能是一个很有前景的综合研究候选基因，也是未来基因治疗的可能位点。但外周血中表达的情况尚未报道。笔者发现，鼻咽患者外周血中miR-31-5p 的表达水平与正常健康人存在明显差异，并随肿瘤分期的进展表达水平随之下降。这说明miR-31-5p 在鼻咽癌中扮演抑癌基因的角色。因此外周血中miR-31-5p 可能成为鼻咽癌早期诊断的一个潜在标记物。但是本组研究中miR-31-5p 的表达水平与肿瘤是否发生远处转移无关，这种结果的出现考虑与样本量较小有关。

近十年来，miRNAs 在放疗抵抗中的调控作用和机制一直是肿瘤研究的热点。miRNAs 的表达受辐射调控，而改变后的miRNAs 通过多种细胞信号通路和多种生物过程改变肿瘤对放射的敏感性［19］。放疗抵抗是鼻咽癌治疗失败一个主要原因，而miRNAs 与鼻咽癌的放疗抵抗有密切关系［20-21］。有研究［22］显示miR-31-5p 在放疗抗性的食道癌细胞中存在低表达，而重新再表达后可以明显恢复肿瘤细胞对放疗的敏感性。另一项有关直肠癌动物模型的研究［23］发现，抑制miR-31-5p 的表达可以提高肿瘤细胞对放疗的抵抗，其作用机制与调节hMLH1 的水平有关。上述研究说明miR-31-5p 低表达可以引起放疗抵抗作用。本研究发现，在放疗1年后复发的鼻咽癌患者中，miR-31-5p 的表达水平亦低于未复发的患者，这也提示miR-31-5p 的低表达可能导致放疗抵抗，从而降低鼻咽癌对放疗的敏感度，这与上述研究的观点一致。

当然，本研究仅是对外周血miR-31-5p 的初步研究，仍存在一些不足之处。如：样本量不够大；鼻部炎性病变或者癌前病变的患者未纳入研究；未对比同一患者外周血与活检组织中miR-31-5p表达水平的差别；放疗过程中、放疗结束后未监测miR-31-5p 动态表达水平的变化；未就miR-31-5p表达水平的高低与生存时间的长短进行分析。但是，本研究发现鼻咽癌患者外周血miR-31-5p 的表达水平较健康人明显降低，并与肿瘤的分期以及放疗效果相关，将可能作为鼻咽癌早期诊断及预后评估的分子标志物。目前miR-31-5p 在鼻咽癌中发挥的分子机制尚不清楚，因此课题组下一步将探讨miR-31-5p 对鼻咽癌细胞的生物学影响，阐明其下游分子作用机制，为深入理解鼻咽癌的发病机制和寻找靶向药物奠定理论基础。