养心通脉方对心肌梗死后大鼠缺血心肌血管新生及相关生长因子表达的影响

杨清华，王庆高，潘朝锌，张振千，张以昆，邢俊娥，李瑜欣

（广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023）

心肌梗死属于中医的“胸痹”“心痛”范畴，中医多从气虚血瘀病机论治，具有较好疗效。本研究主要观察养心通脉方对心肌梗死大鼠缺血心肌血管新生的影响，通过检测心肌梗死面积和左室面积比，大鼠边缘区心肌微血管数（MVC）、微血管密度（MVD）、梗死边缘区心肌组织的血小板源生长因子（PDGF）及胰岛素样生长因子（IGF-1）的表达来探讨其作用机制，以期为临床治疗提供依据，现将结果报道如下。

1 实验材料

1.1 动物 健康雌性SD大鼠（清洁级）120只，体重为230±20 g，购自郑州大学动物中心（合格证号：410116）。

1.2 药物与试剂 养心通脉方（由人参10 g、黄芪15 g、麦冬10 g、五味子10 g、当归10 g、丹参15 g、川芎10 g、白芍10 g、木香6 g、甘草6 g组成），中药由广西中医药大学第一附属医院药剂科统一购入，并煎制成膏剂，1 ml相当于生药1 g；麝香保心丸（由上海和黄药业有限公司生产，批号A040214，每丸22.5 mg）。PDGF、IGF-1免疫组化试剂盒由武汉博士德生物工程有限责任公司提供，BAD显色试剂盒由北京中山公司提供。

1.3 仪器 江西特力麻醉呼吸设备公司的小动物呼吸机（TKR-200C）；日本YMPUS光学有限公司的显微镜（CH20BIMF200）；德国蔡司公司的石蜡切片机（HM340E）；成都泰盟科技有限公司的BT 2000医用图像分析系统（3.6 BuiId 0211）。

2 方法

2.1 动物模型制备 参照《实验动物学》心肌梗死的动物模型制作方法［1］，采用1%戊巴比妥钠腹腔内注射以麻醉大鼠，背位固定后行气管插管术，并连接小动物呼吸机行人工呼吸。开胸后结扎左冠状动脉根部，结扎点定在左冠状动脉主干位于主动脉圆锥与左心耳之间的连线下0.1 cm处，即刻心脏表面颜色变化和记录的体表心电图Ⅰ、aVL导联ST段弓背向上抬高提示造模成功；缝合胸壁观察大鼠状态平稳后停止呼吸机人工呼吸，术后预防感染注射青霉素3天。将存活动物按随机表随机分为5组：模型组、麝香保心丸组、养心通脉方高剂量组、养心通脉方中剂量组及养心通脉方低剂量组；正常对照组手术方法同上，但只在冠脉下穿线打一松结；6周后立即处死，进行各指标的检测。

2.2 动物分组与给药方法 将120只清洁级健康雌性SD大鼠，体重在200±20g，按随机表随机分为6组，每组20只：A正常对照组；B模型组；C麝香保心丸组；D养心通脉方低剂量组（药量1 ml/d）；E养心通脉方中剂量组（药量2 ml/d）；F养心通脉方高剂量组（药量4 ml/d），用药剂量分别按动物体表面积换算。用药组造模成功后次日开始于每天上午8时灌胃给药，正常对照组和模型组予等量生理盐水灌胃，每日1次，分笼饲养，自由饮食，共观察6周后立即处死。

2.3 大鼠心肌取材方法 麻醉大鼠后立即迅速摘取大鼠心脏，剪除主动脉弓及右侧心室、心房、心耳，在乳头肌横切面切取大鼠心肌组织（其中包括梗死区、移行区、健存区），用10%中性缓冲福尔马林液固定标本，石蜡包埋，制备成厚度4 μm的组织切片。

2.4 观察指标及方法

2.4.1 心肌梗死面积的测定 心脏标本切片进行苏木素-伊红（HE）染色，在光镜下观察心肌情况。用高清晰彩色病理图像分析仪测量系统（Noesis S.A France）检测大鼠急性心肌梗死面积与左室面积，梗死面积（%）=梗死心肌面积/左室面积×100%。

2.4.2 大鼠边缘区心肌微血管数（MVC）、微血管密度（MVD）测定 用免疫组化SP法染色，染色后组织切片血管内皮细胞被染成黄色、棕色。微血管判断标准：以染成棕黄色单个内皮细胞或内皮细胞簇作为一个血管进行计数，如管腔大于8个红细胞大小、带有较厚肌层血管区域的血管均不能进行计数，注意不以出现红细胞、是否有管腔出现来计数血管。具体方法:首先在光镜高倍视野（×40）下定位大鼠心肌梗死边缘区，然后在高倍视野（×400）下进行梗死边缘区微血管计数，在每张切片中随机抽取5个视野并计数每个视野的MVC，取均值作为MVC值；由于MVD是以毛细胞血管个数/视野表示，因此MVC值即MVD值。

2.4.3 大鼠MI边缘区PDGF、IGF-1蛋白表达检测 采用免疫组化SP法，PDGF-β、IGF-1蛋白的表达阳性反应是以细胞内出现棕黄色颗粒沉着为标准。采取病理图像分析系统计算MI边缘区心肌每视野（×100）中的平均灰度值（MOD），在每张切片中随机测定6个视野，取平均值。

2.5 统计学方法 全部数据采用SPSS12.0统计软件分析。计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验，等级资料采用Ridit分析。P＜0.05为有显著性差异。

3 结果

3.1 各组大鼠心肌梗死面积比较 治疗后养心通脉方各剂量组大鼠梗死面积（%）和模型组相比明显减低，有显著性差异（P＜0.05）；与麝香保心丸组相似（P＞0.05）。见表1。

表1 养心通脉方各剂量组对大鼠心肌梗死面积的影响

表1 养心通脉方各剂量组对大鼠心肌梗死面积的影响

注：与正常对照组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05；与麝香保心丸组比较，③P＞0.05

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3.2 各组大鼠梗死边缘区MVC、MVD比较 各组均可见到新生微血管，与正常对照组比较，模型组与各治疗组大鼠MI边缘区MVC和MVD明显增高（P＜0.05）；与模型组比较，各治疗组均比模型组明显增高（P＜0.05）；与麝香保心丸组比较，养心通脉方高、中剂量组比麝香保心丸组显著增高（P＜0.05），养心通脉方低剂量组与麝香保心丸组相似（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠梗死边缘区MVC、MVD比较

表2 各组大鼠梗死边缘区MVC、MVD比较

注：与正常对照组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05；与麝香保心丸组比较，③P＜0.05

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3.3 各组大鼠MI边缘区PDGF-β、IGF-1比较 模型组与各治疗组大鼠MI边缘区PDGF-β、IGF-1明显增高，与正常对照组比较有显著性差异（P＜0.05）。与模型组比较，养心通脉方各剂量组与麝香保心丸组PDGF-β、IGF-1明显增高（P＜0.05）；养心通脉方高、中剂量组比麝香保心丸组增高更显著（P＜0.05）；养心通脉方低剂量组与麝香保心丸组相比无显著性差异（P＞0.05）。见表3。

表3 各组大鼠MI边缘区PDGF、IGF-1比较

表3 各组大鼠MI边缘区PDGF、IGF-1比较

注：与正常对照组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05；与麝香保心丸组比较，③P＜0.05

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4 讨论

冠心病属于中医的“胸痹”“心痛”范畴，属“脏气虚于内，痰瘀痹于中”的本虚标实证，气虚血瘀始终贯穿疾病的不同病理阶段。中医药治疗心血管相关病证有悠久历史，有不少关于“气血互根”“脉为血之府”“补气活血”“行气通脉”“活血化瘀”“活血生肌”的理论，这就为中医药促血管生成作用奠定了理论基础。养心通脉方是全国名老中医李锡光主任治疗冠心病心绞痛的经验方，主要由人参、黄芪、麦冬、五味子、当归、丹参、川芎、白芍、木香、甘草等组成，方中人参大补元气，为君药；黄芪助人参以加强补气的作用，为臣药；参芪合用，则心气、元气皆旺；而麦冬、五味子合人参即生脉饮之意，所谓生脉者，正气旺，血脉充，血脉充则瘀血自散，当归、丹参、川芎活血化瘀，通脉止痛，白芍合甘草，有酸甘化阴、缓急止痛之功效，木香既可芳香温通，又可行气止痛，增强活血化瘀之功，共为佐药，甘草调和诸药为使药，全方共奏大补元气、益气养阴、活血化瘀的功效，正切合病机。现代药理研究表明，方中君药人参的有效成分人参皂苷有促进血管生成的作用，其他单味中药丹参、当归、黄芪、川芎等均对冠心病有不同程度的促血管生成作用［2-5］。

促血管生成作用机制是由血管生成生长因子及一系列细胞生长因子通过刺激内皮细胞生长和迁移，诱导和／或促进血管新生，从而促进其相关组织的修复和生长。本研究通过对养心通脉方促心肌梗死后大鼠缺血心肌血管新生及对相关生长因子表达的影响，探讨养心通脉方促血管新生作用机制，结果表明养心通脉方各剂量组大鼠心肌梗死范围明显减小，心肌梗死边缘区MVC、MVD明显升高，PDGF-β、IGF-1蛋白表达明显增高，提示养心通脉方能缩小大鼠心肌梗死面积，并能促进梗死后大鼠缺血心肌的血管新生，对心肌梗死大鼠缺血心肌具有保护作用，而上调心肌梗死边缘区PDGF-β、IGF-1表达可能是其作用机制之一。