胃癌细胞中乳酸脱氢酶A表达变化及其对EMT的影响

陈妍，陈加华，李小琴

(1江苏大学附属医院，江苏镇江212031；2徐州医科大学附属淮安医院；3沭阳仁慈医院)

胃癌是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤[1]。资料显示，2015年我国胃癌发病67.91万例，死亡49.8万例，发病率与病死率均居世界首位[2]。肿瘤侵袭与转移是影响患者治疗后复发的关键，因此寻找胃癌特异性生物学指标对治疗胃癌及探究胃癌的侵袭与转移机制具有重要意义。研究显示，上皮间质转化(EMT)在胃癌的侵袭与转移中起核心作用[3]。乳酸脱氢酶A(LDH-A)是糖酵解途径中的关键酶，其高表达与恶性肿瘤的发生、发展及侵袭、转移密切相关[4]。蔡志煅等[5]报道，上调LDH-A表达能够增强前列腺癌细胞的糖酵解途径，促进前列腺癌细胞增殖。LDH-A是否参与了胃癌细胞的EMT过程，目前鲜有报道。2018年2～9月，我们观察了胃癌细胞中LDH-A的表达变化，并采用siRNA技术沉默LDH-A表达，观察其对胃癌细胞EMT的影响，旨在探讨LDH-A在胃癌进展中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料 人胃癌细胞株OCUM-1购自南京科佰生物科技有限公司，人正常胃黏膜上皮细胞株RGM-1购自上海基免生物科技有限公司。Lipfoctamine2000转染试剂购自赛默飞世尔科技有限公司，siRNA无义对照序列、LDH-A siRNA由上海中洪博元生物技术公司设计并构建，RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、SYBR Green PCR Kit购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司。

1.2 细胞培养 将OCUM-1细胞和RGM-1细胞复苏后，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。当细胞融合度接近90%时，进行消化传代。

1.3 细胞分组与干预 将OCUM-1细胞随机分为空白对照组、转染对照组和LDH-A siRNA组。空白对照组只加入培养基，转染对照组转染siRNA无义对照序列，LDH-A siRNA组转染LDH-A siRNA序列。培养细胞至融合度约50%时进行siRNA转染，转染方法参照Lipfoctamine2000脂质体转染试剂说明书。转染48 h后，收集各组细胞。

1.4 细胞中LDH-A mRNA检测 采用qRT-PCR法。取对数生长期细胞，采用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，采用反转录试剂盒反转录RNA得到cDNA。采用SYBR Green PCR Kit对LDH-A进行相对定量，反应体系20 μL，反应条件：90 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共45个循环。所有样品均重复测定3次。引物序列：LDH-A上游5′-GTCAGCAAGAGGGAGAAAGC-3′，下游5′-ATTCCACTCCATACAGGCACA-3′；内参GAPDH上游5′-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3′，下游5′-CAAAGCTCATGGATGACC-3′。采用2-ΔΔCt法对LDH-A水平进行定量分析。

1.5 细胞中LDH-A蛋白检测 采用Western blotting法。收集对数生长期细胞，PBS清洗，于冰上裂解离心后，吸取上清用于蛋白含量分析。采用Bio-Rad方法测定蛋白质浓度，然后进行10% SDS-PAGE电泳，转膜，一抗4 ℃孵育过夜，TBST漂洗3次，二抗室温孵育1.5 h，TBST漂洗3次，每次分别漂洗10 min，ECL化学发光法显色。GIS凝胶成像分析系统拍照，以GAPDH作为内参照，分析各蛋白相对表达量。重复测定3次。

1.6 细胞形态学观察 收集各组细胞，置于倒置显微镜下观察细胞形态学变化，拍照并保存。

1.7 EMT相关蛋白表达检测 采用Western blotting法检测上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)、细胞角蛋白(Cytokeratin)、神经型钙黏蛋白(N-cadherin)、锌指转录因子(Snail)、β连环蛋白(β-catenin)、波形蛋白(Vimentin),检测步骤同“1.5”。

2 结果

2.1 OCUM-1细胞与RGM-1细胞中LDH-A mRNA及蛋白表达比较 OCUM-1细胞中LDH-A mRNA及蛋白表达水平均高于RGM-1细胞(P均<0.05)。见表1。

2.2 各组OCUM-1细胞LDH-A mRNA及蛋白表达比较 LDH-A siRNA组LDH-A mRNA及蛋白表达均低于空白对照组、转染对照组(P均<0.05)。见表2。

表1 胃癌与正常胃黏膜细胞中LDH-A mRNA及蛋白表达比较

注：与RGM-1细胞比较，*P<0.05。

表2 各组OCUM-1细胞LDH-A mRNA及蛋白表达比较

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与转染对照组比较，#P<0.05。

2.3 各组OCUM-1细胞形态学表现 空白对照组、转染对照组细胞排列松散，扩散细胞数量多，细胞间黏附明显被破坏，部分细胞呈明显梭形，表现为间质细胞特性；LDH-A siRNA组细胞排列紧密，细胞黏附性增加，逐渐表现为上皮细胞特性。见图1。

注：图中箭头所指细胞呈明显梭形。

图1 各组OCUM-1细胞形态学比较

2.4 各组OCUM-1细胞EMT相关蛋白表达比较 LDH-A siRNA组E-cadherin、Cytokeratin蛋白表达高于空白对照组、转染对照组，N-cadherin、Snail、β-catenin、Vimentin蛋白表达低于空白对照组、转染对照组(P均<0.05)。见表3。

表3 各组OCUM-1细胞EMT相关蛋白表达比较

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与转染对照组比较，#P<0.05。

3 讨论

胃癌的发病率与病死率均较高，虽然近年来随着医疗技术的进步，胃癌的治疗效果得到提升，但总体治疗效果仍不尽人意。导致胃癌迅速进展的主要原因是肿瘤细胞的浸润与转移[6],因此寻找能够抑制肿瘤细胞浸润和转移的特异性肿瘤标志分子，对于胃癌的靶向治疗具有重要意义。

LDH-A属于乳酸脱氢酶家族同工酶，其主要功能是催化丙酮酸转化为乳酸，是影响糖酵解的关键酶之一[7]。与正常细胞相比，肿瘤细胞的代谢特点是即使在有氧的条件下也能够进行糖酵解。研究表明，LDH-A在淋巴瘤等多种肿瘤组织中均表达上调，且其表达水平与肿瘤分化程度关系密切[8]。Zhai等[9]报道，抑制LDH-A表达能够抑制鼻咽癌细胞增殖，诱导G2/M细胞周期停滞，促进细胞凋亡。本研究结果显示，胃癌OCUM-1细胞LDH-A mRNA及蛋白表达均高于正常胃黏膜上皮细胞，提示LDH-A在胃癌细胞中表达上调，可能作为促癌因子发挥作用。

EMT是指上皮样细胞在病理与生理条件下向间质样细胞转化的现象，上皮细胞由原先长方形、扁圆形或立方形等规则的上皮细胞，变为纺锤形、梭形、星形等不规则的间质细胞；细胞骨架发生改变，进一步使上皮细胞失去极性，细胞之间的连接性和黏附性降低，获得较高的浸润与转移、抑制凋亡等能力[10]。本研究通过siRNA技术沉默胃癌细胞中的LDH-A表达，观察细胞形态的变化，结果显示空白对照组、转染对照组胃癌细胞排列松散，扩散细胞数量多，细胞间黏附明显被破坏，部分细胞呈明显梭形，表现为间质细胞特性；LDH-A siRNA组胃癌细胞排列紧密，细胞黏附性增加，逐渐表现为上皮细胞特性。提示LDH-A表达下调可促使胃癌细胞维持上皮样细胞特性，抑制肿瘤细胞浸润、转移，但其具体机制还不清楚。

EMT参与了肿瘤的发生发展过程。肿瘤细胞发生EMT后，除黏附性降低等形态特征改变外，还伴随着上皮细胞特征蛋白E-cadherin、Cytokeratin和间质细胞特征蛋白N-cadherin、Snail、β-catenin、Vimentin表达的改变[11]。E-cadherin蛋白参与同型细胞间的黏附连接，在维持细胞形态及极性中具有重要作用，是一种经典的上皮细胞标志物。Cytokeratin是构成细胞骨架的一类中间丝状物，是另一种上皮细胞特征标志物[12]。N-cadherin蛋白表达可促进肿瘤的浸润与转移[13]。Snail是EMT相关标志物，具有下调E-cadherin蛋白表达的作用。β-catenin是钙黏蛋白复合体的亚基，主要介导细胞间黏附和参与基因表达[14]。Vimentin是细胞骨架蛋白中的一种，广泛分布于各种内皮细胞、成纤维细胞等间质细胞中，在维持间质细胞形态、调节细胞黏附分子和细胞骨架蛋白等蛋白间相互作用中发挥重要作用[15]。Scarpa等[16]研究结果表明，EMT伴随E-cadherin蛋白向N-cadherin蛋白的转化，钙黏蛋白转换通过由细胞复极化产生更强的作用力，使细胞间连接分解。苏醒等[17]研究发现，Snail蛋白高表达和E-cadherin蛋白低表达与胆管癌的发生、浸润与转移(胆管结石上皮细胞恶性转化)有关。袁明等[18]研究表明，结肠癌细胞EMT过程中伴随着β-catenin与N-cadherin蛋白表达上调和E-cadherin蛋白表达下调。张灿灿等[19]报道，E-cadherin蛋白表达在上皮性卵巢癌细胞中表达下调，Vimentin及Snail蛋白表达上调，E-cadherin、Vimentin与Snail蛋白的表达调控与EMT过程有关。本研究结果显示，转染LDH-A siRNA后，胃癌OCUM-1细胞中E-cadherin、Cytokeratin蛋白表达显著升高，N-cadherin、Snail、β-catenin、Vimentin蛋白表达显著降低，表明LDH-A siRNA可使E-cadherin等上皮细胞特征蛋白表达上调，N-cadherin等间质细胞特征蛋白表达下调，提示LDH-A siRNA可能抑制胃癌细胞EMT过程。

综上所述，胃癌细胞中LDH-A表达升高；沉默LDH-A表达可上调胃癌细胞上皮细胞特征蛋白表达、下调间质细胞特征蛋白表达，从而抑制胃癌细胞的EMT进程。本研究仅探究了LDH-A在胃癌细胞中的表达情况及其对胃癌细胞EMT相关蛋白的影响，具体调控机制仍需进一步深入研究。