LY354740改善氯胺酮暴露引起青春期C57BL/6小鼠的空间学习记忆功能损害与焦虑

温博伦, 陈伟明, 陈晓彤, 詹鸿, 周立兵, 王寿平

(1.广州医科大学 附属第三医院麻醉科, 广东 广州 510150; 2.中山大学 孙逸仙纪念医院， 广东 广州 510000; 3.粤港澳中枢神经再生研究院， 广东 广州 510000)

氯胺酮是目前世界上儿童、青少年患者常用的全麻药物之一，具有同时镇静及镇痛的特点[1].然而其亦是社会上年轻人娱乐滥用的毒品之一.有研究报道氯胺酮可分别通过诱发谷氨酸毒性、激活炎症通路、诱导氧化应激损伤等多种方式引起神经发育障碍、神经元凋亡、坏死、功能异常等现象，此等病理生理改变均可导致神经退行性疾病加速发展[2-5].另外，人体试验及临床实验均表明长期滥用者均有不同程度的认知功能障碍及不同类型的情绪障碍.青少年时期学习记忆、情绪、辨别是非等能力方面很容易受影响，属于较脆弱或不稳定期，如若合并有氯胺酮暴露史甚至滥用，很有可能造成比预期严重的神经系统功能的损害.因此，明确氯胺酮损伤机制并探索可能的防治措施具有重要临床及社会意义.促代谢性谷氨酸受体(metabotropic glutamate receptors, mGluRs)在突触传递调控过程中扮演重要角色，通过与G蛋白耦联调节离子型受体功能，对以谷氨酸为主递质传递进行调控.有研究指出代谢性谷氨酸2型及3型受体(mGluR2/3s)激动剂LY354740能有效改善与认知功能相关的信号转导通路[2, 6]，至于其是否能改善氯胺酮诱发的认知功能下降仍未有明确定论.本研究拟探究LY354740预先给药处理是否能通过调控谷氨酸释放，改善氯胺酮引起青春期C57BL/6小鼠学习记忆功能及情绪异常改变.

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

选取健康雌性SPF 级C57BL/6 小鼠39只，6～8周龄，体质量(20±5)g，购于广东省医学实验动物中心(许可证号：SCXK 2013-0002)，于室内温度22℃，湿度50%，小鼠自由饮水和摄食.采用随机数字表法，将其分为3组(n=13):空白对照组(C组)、氯胺酮组(K 组)及LY354740干预组(L组).

1.2 方法

1.2.1 用药干预小鼠制备

K 组和L 组均腹腔注射氯胺酮质量分数30 mg/kg(质量浓度为50 mg/mL，福建古田药业有限公司)，每隔30 min 重复注射1次，每天注射氯胺酮3 次，连续2 周.L 组在首次注射氯胺酮前30 min注射LY354740(MCE公司，HY-18941，50 mg配制成质量浓度为2 mg/mL的溶液)质量分数10 mg/kg，C 组注射等量生理盐水.于给药前(D0)、第1天给药后(D1)、第4天给药后(D4)、第7天给药后(D7)、第14天给药结束(D14)共5个时间点对小鼠体质量进行测量，以评估生长状况.

1.2.2 海马组织谷氨酸浓度测定

每组从中各取3只，第1天给药结束30 min行颈椎脱臼，冰面上迅速取新鲜海马组织，按每克组织加入BioVision Glutamate Colorimetric Assay Kit中的Assay Buffer 2 mL，冰浴匀浆，4 ℃ 13 000g离心15 min，取上清液于灭菌EP管，按说明书步骤进行谷氨酸浓度测定，结果以μmol/g表示.

1.2.3 行为学检测

余下小鼠继续前述方法每日重复给药.末次注射24 h 后进行行为学测试，包括旷场实验测试、Morris 水迷宫，以评估认知功能.①末次注射后第1天行旷场试验.从小鼠放置在中央格时计时，记录5 min内中央区活动时间、周边区活动时间、总路程及平均速率.②旷场实验结束后1 d行Morris水迷宫测试.在定位航行实验中，记录小鼠游泳速率和逃避潜伏期.在定位航行试验第4 天完成之后行空间探索试验.此时平台从第NW象限移除.小鼠从定位航行实验平台放置象限相对的象限即SE象限入水，每次进入小鼠游泳60 s 后停止.记录原平台区域穿越次数和到达原平台区潜伏期.

1.2.4 统计学处理

2 结果

2.1 造模用药与干预措施

造模用药与干预措施未引起青春期C57BL/6小鼠明显生长发育抑制，各组小鼠各时点体质量比较均无统计学差异(P>0.05，图1).

D0和D1各组n=13，D4、D7和D14各组n=10.

At D0 and D1,n=13 in each group; at D4, D7 and D14,n=10 in each group.

图1 各时间点各组小鼠体质量变化比较

Fig.1 Changes of body weight in mice at different time points

2.2 LY354740预先给药可抑制氯胺酮诱发的海马组织谷氨酸质量分数上升

与C组比较，K组的谷氨酸质量分数升高，有统计学差异(P<0.01)，L组无明显统计学差异(P>0.05，图2).

与C组比较，1)P<0.01.

2.3 LY354740预先给药能改善氯胺酮导致的焦虑水平上升

各组小鼠的平均速度、总移动路程均没有明显统计学差异(P>0.05).与C组相比，K、L组在中心区活动时间均相应缩短，有统计学差异(P<0.01)，且K组穿越中央区次数明显减少(P<0.01)，而L组穿越中央区次数无统计学差异(P>0.05).L组中央区指标相比K组有明显改善，有统计学差异(P<0.05，图3).

2.4 LY354740预先给药能改善氯胺酮所导致的空间学习记忆能力损害

(1)5 d的水迷宫实验中各组的平均速度均无统计学差异(P>0.05).

与C组比较， 1)P<0.01；与K组比较，2)P<0.05.

Compared with group C, 1)P<0.01; compared with group K, 2)P<0.05.

A:移动总路程；B:平均运动速度，评价小鼠在旷场中自主运动情况；C:中央区停留时间；D:中央区进入次数，以评价焦虑水平指标.E:a、b、c依次为C组、K组、L组小鼠运动路径.

A: Total distance moved during the trial; B: Mean velocity for evaluating autonomous movement of mice; C: Duration in centre; D: Entries in centre, an index for evaluating anxiety; E:a, b and c respectively representing tracks of mice in group C, group K and Group L.

图3 各组小鼠在旷场实验指标及路径

Fig.3 Results and tracks of open field test

(2) 定位航行实验中，与C组比较，K组在第3、4天的逃避潜伏期明显延长(P<0.01)，L组第4天无明显统计学差异；与K组相比，L组第4天逃避潜伏期缩短(P<0.05).

(3) 空间探索实验中，与C组相比，K组到达原平台位置潜伏期明显延长(P<0.01)，穿越原平台次数减少(P<0.05)，而L组回到原平台位置潜伏期延长(P<0.05)，穿越原平台次数未有明显统计学差异(P>0.05)；与K组相比，L组回到原平台位置潜伏期明显缩短，具有统计学差异(P<0.05)，穿越原平台次数则未有明显统计学差异(P>0.05，图4).

3 讨论

氯胺酮是一种非竞争性NMDA受体拮抗剂，由于其价格低廉，并且同时提供镇静、镇痛效果，目前在许多发展中及落后国家、地区仍在广泛使用.有相当多的研究及报道指出氯胺酮麻醉与术后认知功能障碍发生关系密切.氯胺酮滥用在青少年、成年人群体并没有明显减少的趋势，其滥用者均会出现不同程度的认知功能损害，不仅影响个人身心健康，而且对家庭及社会产生沉重负担.由于目前对氯胺酮损害认知功能的机制尚未明确，因此仍需要积极寻找防治措施.

与C组比较，1)P<0.05，2)P<0.01；与K组比较，3)P<0.05，4)P<0.01.

Compared with group C, 1)P<0.05, 2)P<0.01; compared with group K, 3)P<0.05, 4)P<0.05.

A:前4 d定位航行平均速度；B:空间探索平均速度；C:定位航行4 d各组逃避潜伏期变化： D、E:空间探索指标;F:游泳轨迹图.

A: Mean velocity in the 4-day navigation test; B: Mean velocity in spatial exploration test; C: Latency to the platform in the 4-day navigation test; D and E: Indexes for evaluating spatial exploration test; F: Swimming tracks of mice among groups.

图4 水迷宫实验各组小鼠各项指标及轨迹图

Fig.4 Results and tracks of water maze test

陈晨等[7]的一项研究表示亚麻醉剂量对老年大鼠认知功能并没有影响，而麻醉剂量则会导致认知功能下降.小剂量氯胺酮进入脑内首先拮抗的是分布在GABA能神经元上的N甲基-D-天冬氨酸(N-methyl D-aspartic acid receptor, NMDA)受体，对边缘系统产生兴奋作用.此种效果使得小剂量单次应用氯胺酮预防术后认知功能障碍成为可能.本研究发现，应用反复多次小剂量的氯胺酮后，小鼠出现兴奋行为，而并非镇静，检测结果提示海马区兴奋性谷氨酸增加与后期出现学习记忆功能损害及焦虑水平上升有关.本结果与一些氯胺酮诱发啮齿动物认知功能损害的研究均提示学习记忆功能障碍可能与氯胺酮诱发的谷氨酸浓度明显升高有关[8-9]，暗示谷氨酸兴奋性毒性参与认知功能损害.

mGlu2/3型受体激动剂LY354740能激动在突触前膜和星形胶质细胞膜上的mGlu2/3型受体，改善突触传递[10].顾兵等[11]亦指出激动mGlu2/3型受体能发挥神经保护作用.本研究结果显示，LY354740预先给药能预防随后氯胺酮暴露诱发的小鼠海马区谷氨酸质量浓度明显升高.该组数据未与模型组产生明显统计学差异，这可能与样本量较小有关，但其变化趋势仍提示mGlu2/3型受体参与谷氨酸调控，能改善氯胺酮导致的焦虑情绪及空间学习记忆功能.有研究者应用谷氨酸脱羧酶抑制剂增加内源性mGlu2/3型受体激动物质N-乙酰-天冬氨酰谷氨酸的质量浓度，减少细胞间隙谷氨酸质量浓度，可以减轻另一种NMDA受体拮抗剂MK801对认知功能的损害作用[12]，说明mGlu2/3型受体有很大可能成为缓解谷氨酸兴奋性毒性相关疾病的重要治疗靶点.

一项对mGlu2/3型受体激动剂LY2140023治疗精神分裂症的临床试验中，与标准抗精神病药对比，LY2140023没有对阳性或阴性症状产生更大的治疗作用，但不能否定的是mGlu2/3型受体仍然是神经保护、抗精神病方面有前景的治疗靶点[13].近年，表观遗传学在麻醉毒性的预防与治疗及神经精神疾病治疗中的指导性日益增加，表观遗传可为此类疾病的防治提供启示[14].mGlu2/3型受体作为精神疾病治疗的靶点仍具有巨大的潜力[15]，因而目前需要更深入的研究或者开发新的mGlu2/3型受体相关药物.

综上所述，本实验表明氯胺酮引起海马区谷氨酸质量浓度升高，可导致青春期C57BL/6小鼠的认知功能损害，LY354740预先给药能有效减轻氯胺酮所导致的焦虑及学习记忆缺陷，可能与其激动mGlu2/3型受体减少海马区谷氨酸，减轻谷氨酸兴奋性神经毒性有关.