人血管紧张素Ⅱ2型受体AT2R重组细胞系的构建与鉴定

陈惠莹，毛莹莹，裴娜娜，颜仁和，万鹏飞，李红卫

(1.南方医科大学 检验与生物技术学院， 广东 广州 510515； 2.暨南大学 附属第一医院 病理科， 广东 广州 510163；3. 广州伯尼兹生物科技有限公司， 广东 广州 510663)

前列腺癌是威胁当今老年男性健康的恶性疾病之一，在男性常见肿瘤中排第2位，同时也是癌症相关死亡的第5大常见原因[1].在中国，前列腺癌的发病率虽远低于西方国家，但近年前列腺癌早期诊断检查普及，检出率与发病率呈上升趋势，占泌尿系统肿瘤第2位[2].

肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)由肾素、血管紧张素转换酶、血管紧张素原和多种血管紧张素肽组成，是体内调节水、电解质、体液平衡和血压的重要激素系统.肾素催化血管紧张素原水解最终产生的血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, AngⅡ)是RAS系统的主要效应分子，AngⅡ通过1型(angiotensin Ⅱtype 1 receptor, AT1R)和2型(angiotensin Ⅱtype 2 receptor, AT2R)受体结合而发挥生物学作用.近年研究发现AngⅡ在肿瘤发生发展中起关键的作用[3]，当与AT1R结合时，会导致细胞增殖和迁移、血管生成进而引起肿瘤的生长与转移；与AT2R结合时，产生抑制肿瘤生长、诱导凋亡的作用[4-5].在大多数环境状态下，AT2R都表现出与AT1R相对立的效应.近年来，一种新型AT2R激动剂Compound 21(C21)为AT2R的研究提供了新的思路.C21是一种非肽类AT2R特异性激动剂，在体内外可与AT2R特异性结合发挥类似于AngⅡ的生理学效应[6].由于AT2R在大部分肿瘤细胞中的表达水平较低，且在前列腺癌和胰腺癌的研究结果中显示，随着肿瘤的发生发展，AT2R的表达水平显著降低[7]，使C21在抗肿瘤中的应用受到限制，也使其他AT2R非特异性激动剂受到AT1R的干扰.

慢病毒载体是一种复制缺陷型反转录病毒载体，具有转染效率好、感染效率较高、基因表达稳定的特点.重组慢病毒可将携带的外源基因高效整合至宿主细胞基因组中，使外源基因在细胞内长期稳定表达[8].本研究在课题组前期研究基础上，构建人AT2R重组慢病毒表达载体，并感染PC-3、DU145细胞建立hAT2R过表达稳定细胞系，探讨C21等AT2R激动剂对前列腺癌的作用与机制，为探索C21作为新型前列腺癌治疗药物提供细胞模型与实验依据.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

PC-3细胞株、DU145细胞株及pLV-CMV-IRES-eGFP质粒由南方医科大学生物治疗研究所保存.

1.1.2 试剂

感受态大肠杆菌DH5α购自北京天根生化科技有限公司；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自北京康润科技有限公司；NheI限制性内切酶、MluI限制性内切酶、T4 DNA连接酶均购自北京宝日医生物技术有限公司；RNAiso Plus、反转录试剂盒、高保真PCR酶PrimerSTAR、SYBR Premix Ex TaqTM 均购自Takara公司；聚醚酰亚胺(polyetherimide，PEI)、胎牛血清购自Sigma公司；DMEM、F-12k细胞培养基与青霉素-链霉素购自ThermoFisher公司；CCK-8细胞活力检测试剂盒购于日本同仁公司；抗兔AT2R一抗购于北京奥维亚生物技术有限公司；抗兔GAPDH一抗购于bioworld公司，HRP标记抗羊兔二抗为杭州弗德生物科技有限公司产品.

1.1.3 仪器设备

Veriti 96 well Thermal Cycler PCR仪购自Applied Biosystems；分光光度计购自Bio-rad;荧光显微镜购自OLYMPUS；5910型小型高速冷冻离心机购自Eppendorf公司；7500荧光定量PCR仪、凝胶成像仪、高速离心机购自ThermoFisher公司.

1.1.4 培养基

体积分数为10% FBS DMEM培养基：DMEM培养基中加入FBS至体积分数为10%，加入青霉素-链霉素细胞培养双抗至终体积分数为1%，混匀后于4℃保存备用；体积分数为10% FBS F-12k培养基：F-12k培养基中加入FBS至体积分数为10%，加入青霉素-链霉素细胞培养双抗至终质量浓度为1%，混匀后于4 ℃保存备用.

1.2 方法

1.2.1 目的基因及引物的设计与合成

根据GenBank中hAT2R基因序列合成目的基因序列，在5′及3′端分别加入NheI及MluI酶切位点，合成的hAT2R基因克隆至pUC57载体中.同时设计合成hAT2R引物序列Forward：5′-CGGAATTCATGAGCTGCGTTAATCC -3′，Reverse：5′-AACTGCAGTTAAGACACAAAGGTCTCCA-3′，以上目的基因及引物委托美吉生物科技有限公司合成.

1.2.2 载体质粒的构建

将pUC57-hAT2R和pLV-CMV-IRES-eGFP质粒用NheI和MluI双酶切，酶切产物经切胶回收得到目的基因hAT2R片段和pLV-CMV-IRES-eGFP载体大片段，用T4 DNA连接酶将回收的目的片段与载体连接并转化至E.coli DH5α感受态，挑取单克隆菌落并提取质粒.获得含有目的基因hAT2R的重组质粒命名为pLV-CMV-hAT2R-IRES-eGFP.重组质粒经酶切及测序鉴定.

1.2.3 重组表达载体的转染

使用PEI转染法将慢病毒载体质粒pLV-CMV-IRES-eGFP和含有目的基因的慢病毒载体连接质粒pLV-CMV-hAT2R-IRES-eGFP分别转染至HEK293T细胞，同时将正常培养的293T细胞作为对照，分别在转染后24、48、72 h使用荧光显微镜观察目的蛋白在细胞内表达情况.

1.2.4 慢病毒载体包装、纯化、浓缩及滴度测定

采用三质粒共转染系统，将鉴定正确的慢病毒重组质粒与慢病毒包装所必须的辅助质粒psPAX2和VSVG共转染至HEK293T细胞.转染细胞使用完全培养基在37 ℃，体积分数为5% CO2细胞培养箱中培养48 h后收集细胞上清液并纯化.纯化后病毒液经10 KD浓缩柱离心浓缩至5 mL.使用RT-PCR法测定病毒滴度，并于-80 ℃保存.

1.2.5 建立hAT2R稳定过表达细胞系

选择生长状态良好的PC-3及DU145两株前列腺癌细胞1.00×106/孔均匀铺于6孔板中，置入37 ℃，体积分数为5% CO2细胞培养箱培养24 h.第2天，去除孔内原培养基，以MOI=1 000加入pLV-CMV-hAT2R-IRES-eGFP病毒液，同时加入聚凝胺(polybrene)使其终质量浓度为8 mg/L，将6孔板放入37 ℃，体积分数为5% CO2环境中培养24 h后更换新鲜的完全培养基继续培养3～5 d，观察细胞荧光情况.使用细胞流式分选法将感染细胞分选并接种于96孔板，培养10 d后挑选96孔板中仅含有1个细胞团的荧光细胞孔即单克隆细胞株，将其传代并扩大培养，获得稳定表达绿色荧光的单克隆细胞系分别命名为PC-3-hAT2R、DU145-hAT2R.

1.2.6 RT-PCR检测hAT2R的基因表达

用RNAiso Plus提取PC-3-hAT2R、DU145-hAT2R细胞总RNA，紫外分光光度仪测得RNA浓度.以每反应体系1 μg加入RNA，按逆转录试剂盒说明步骤进行逆转录操作获得cDNA.以β-actin作为内参，使用SYBR Green法检测目的基因表达.同时设立未转染细胞组作为阴性对照.

1.2.7 Western blot检测重组细胞系hAT2R的蛋白质水平表达

使用RIPA细胞裂解液分别提取PC-3、DU145及PC-3-hAT2R、DU145-hAT2R细胞总蛋白质，以GAPDH作为内参蛋白，免疫印迹法检测各组细胞中AT2R表达量，蛋白质条带灰度分析使用ImageJ软件进行.

2 结果

2.1 pLV-CMV-eGFP-hAT2R载体构建及鉴定结果

将hAT2R基因克隆至慢病毒表达载体质粒pLV-CMV-IRES-eGFP中，NheI及MluI双酶切重组质粒pLV-CMV-hAT2R-IRES-eGFP质粒鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果(图1)，小片段与原始目的基因质粒片段相同，约为1 200 bp左右，符合预期，且大片段与原始载体酶切片段相同.PCR鉴定获得130 bp左右片段(图2).质粒测序鉴定无突变.以上结果证明目的基因慢病毒载体连接质粒pLV-CMV-hAT2R-IRES-eGFP构建成功.

M：DL2000DNA 标记物；1：pLV-CMV-IRES-eGFP；2：pUC57-hAT2R-kana/(NheI &MluI)；3～8：pLV-CMV-hAT2R-IRES-eGFP/(NheI&MluI).

M:DL2000DNA marker; 1:pLV-CMV-IRES-eGFP;2:pUC57-hAT2R-kana/(NheI&MluI);3～8:pLV-CMV-hAT2R-IRES-eGFP/(NheI&MluI).

图1pLV-CMV-hAT2R-IRES-eGFP的酶切鉴定结果

Fig.1 Restrction enzyme digestion analysis ofpLV-CMV-hAT2R-IRES-eGFP

M：DL2000DNA 标记物；1～3：pLV-CMV-hAT2R-IRES-eGFP.

M:DL2000DNA marker;1～3:pLV-CMV-hAT2R-IRES-eGFP.

图2pLV-CMV-hAT2R-IRES-eGFPPCR鉴定结果

Fig.2 Agarose gel electrophoresis analysis ofhAT2Ramplified by PCR

2.2 重组质粒转染293T细胞荧光表达情况

将慢病毒载体质粒pLV-CMV-IRES-eGFP与目的基因慢病毒载体连接质粒pLV-CMV-hAT2R-IRES-eGFP分别转染HEK293T细胞，并与未转染的293T细胞进行对照，转染后24、48、72 h在荧光显微镜下观察荧光表达(图3).RT-PCR检测转染细胞hAT2R表达(图4).结果证明慢病毒质粒转染成功，目的基因蛋白在细胞内高效表达.

图3 质粒转染HEK293T细胞24、48、72 h荧光

对照组：HEK293T cell；eGFP：plv-CMV-IRES-eGFP；hAT2R：pLV-CMV-hAT2R-IRES-eGFP.1)对照组与eGFP组无差异；2)eGFP组与hAT2R组差异显著，P≤0.01.

Control:HEK293T cell; eGFP:plv-CMV-IRES-eGFP; hAT2R:pLV-CMV-hAT2R-IRES-eGFP.1)No difference between the control group and the eGFP group; 2) difference between the eGFP group and the hAT2R group,P≤0.01.

图4 RT-PCR检测质粒转染HEK293T细胞hAT2R表达

Fig.4 Detection of hAT2R expression in HEK293T cells by RT-PCR

2.3 单克隆细胞系的构建

选择两株前列腺癌细胞PC-3及DU145细胞，以MOI=1 000感染48 h后，使用细胞流式分选技术将成功表达绿色荧光的细胞分选至96孔培养板中，每孔1个细胞.培养10 d后，荧光显微镜下观察96孔板细胞，每株细胞各挑选5个荧光强度较强的阳性单克隆(图5)，并扩大培养于6孔板中.最终挑选生长状态好的阳性单克隆持续传代至30代并保存，分别命名为PC-3-hAT2R、DU145-hAT2R.

2.4 重组细胞系hAT2R的表达水平检测

在重组细胞系传代培养至第30代时，收集细胞，RNAiso Plus试剂提取细胞总RNA，同时提取未感染细胞总RNA，逆转录获得cDNA，使用RT-PCR检测目的基因hAT2R表达.重复3次所得结果进行统计学分析(图6).重组细胞系PC-3-hAT2R中hAT2R基因表达是未转染细胞的789倍，DU145-hAT2R中hAT2R基因表达是未转染细胞的621倍，有统计学差异.同时分别提取PC3、DU145细胞及两株重组细胞系细胞总蛋白质，使用Western blot法检测hAT2R蛋白质水平表达(图7)，重组细胞系中目的基因蛋白质表达水平显著升高.

A1～5: PC-3-hAT2R单克隆白光；B1～5: PC-3-hAT2R单克隆荧光；C1～5: DU145-hAT2R单克隆白光；D1～5： DU145-hAT2R单克隆荧光

A1～5: bright-field image of PC-3-hAT2R; B1～5: fluorescence of PC-3-hAT2R; C1～5: bright-field image of DU145-hAT2R; D1～5:fluorescence of DU145-hAT2R.

图5 阳性单克隆细胞图

Fig.5 Monoclonal cell of PC-3-hAT2R and DU145-hAT2R

1)PC-3-hAT2R组较PC-3组hAT2R基因表达水平显著上升，P≤0.05；2)DU145-hAT2R组较DU145组hAT2R基因表达水平显著上升，P≤0.05.

1)Significantly difference between thePC-3-hAT2Rgroup and the PC-3 group,P≤0.05; 2)significantly difference between theDU145-hAT2Rgroup and the DU145 group,P≤0.05.

图6 RT-PCR检测重组单克隆细胞系hAT2R表达

Fig.6 Detection of hAT2R expression in recombinant monoclonal cell line by RT-PCR

图7 Western blot检测重组单克隆细胞系hAT2R蛋白水平表达

Fig.7 Detection of hAT2R expression in recombinant monoclonal cell line by Western blot

2.5 重组细胞系hAT2R受体功能检测

使用浓度为10 μmol/L AT2R激动剂CGP42112分别处理PC-3、DU145细胞及PC-3-hAT2R、DU145-hAT2R重组细胞系，24 h后用CCK-8法检测细胞活力，两株细胞检测结果显示，与PC-3、DU145细胞相比重组细胞系PC-3-hAT2R、DU145-hAT2R细胞存活率明显下降，同时统计分析结果，PC-3、DU145细胞经CGP42112处理后，细胞呈明显增殖趋势(图8).

A:1)PC-3细胞中，CGP42112组与对照组比较，细胞活力升高，P≤0.05；2) PC-3-hAT2R细胞中，CGP42112组较对照组细胞活力降低，P≤0.05；3)CGP42112处理后，PC-3-hAT2R组较PC-3组细胞活力显著降低，P≤0.05.

B:1)DU145细胞中，CGP42112组与对照组比较，细胞活力升高，P≤0.05；2) DU145-hAT2R细胞中，CGP42112组较对照组细胞活力降低，P≤0.05；3)CGP42112处理后，DU145-hAT2R组较DU156组细胞活力显著降低，P≤0.05.

A:1)PC-3 cell: control and CGP42112-treated,P≤0.05;2) PC-3-hAT2R cell: control and CGP42112-treated,P≤0.05;3) CGP42112-treated: PC-3-hAT2R cell and PC-3 cell,P≤0.05.

B:1)DU145 cell: control and CGP42112-treated,P≤0.05;2) DU145-hAT2R cell: control and CGP42112-treated,P≤0.05;3) CGP42112-treated: DU145-hAT2R cell and DU145 cell,P≤0.05.

图8 CCK-8法检测CGP42112处理24 h后各组细胞活力

Fig.8 Detection of cell viability in CGP42112-treated cells by CCK-8

3 讨论

AngⅡ的两种受体AT1R和AT2R是具有30%相似序列的跨膜糖蛋白[9].其中AT2R是胚胎时期AngⅡ的主要受体，调节胚胎期组织、器官的分化和发育，出生后表达量显著下降，仅在机体的大脑某些区域、肾上腺、心脏、肾脏某些结构及子宫肌层和卵巢等特定器官表达，且表达量较低，使AT2R的相关研究受限.现阶段研究显示，与AT1R的有害性相反，AT2R是RAS的保护性分支，且常常与AT1R相拮抗，可能是机体的一种内源性保护机制[10].近年来，AT1R在多种肿瘤中的促细胞生长、血管生成和加速恶性转化的作用已得到证实，而其拮抗剂则表现为抑制肿瘤生长、转移[11].AT2R与AT1R相对立的效应使其作为肿瘤治疗的新靶点也获得越来越多的关注.已有研究发现，AT2R在前列腺癌细胞、膀胱癌细胞和肺癌细胞中表现出抑制细胞增殖并诱导凋亡，可能与AT2R内源性表达导致细胞程序性死亡相关[12].

新型非肽类AT2R激动剂C21，由一种非选择性AT1R/AT2R激动剂L-162，313改造而来，对AT2R的Ki值(浓度为0.4 nmol/L)远远小于对AT1R的Ki值(浓度大于10 μmol/L)，可特异性激活AT2R[13].已有大量研究证实，C21与AT2R结合能够有效发挥的生物学效应包括抗炎、缓解胰岛素抵抗、降低氧化应激、舒张血管、抵抗血管和心肌纤维化、保护神经元等[14-15].C21作为一种新型AT2R激动剂，在治疗肺纤维化的研究已经入一期临床实验[15].此外，CGP42112以及肽类AT2R激动剂AngⅡ也常用于AT2R的研究[16].AngⅡ与AT1R和AT2R均可结合发挥作用，导致其激活AT2R的特异性较差.有研究指出CGP42112对AT2R的激活位点与AngⅡ并不完全相同，其功能不能完全被AT2R拮抗剂PD123319抑制[17-18]，因此CGP42112激活AT2R的特异性也较低，所以，使用CGP42112处理PC-3、DU145细胞24 h后表现促细胞增殖作用，可能激活了AT1R所致.具有高特异性的新型AT2R激动剂C21能否用于前列腺癌的治疗，以及其激活AT2R在前列腺肿瘤细胞中的作用及其机制仍有待探究.

本研究利用人AT2R作为目的基因，构建慢病毒表达载体.慢病毒是目前分子及细胞生物实验中十分高效的工具，在基因重组方面有着许多独特的优势，相比于其他逆转录病毒，慢病毒的可感染宿主广泛，对于一些较难感染的细胞也可有较高的转导效率，可携带5kb，甚至更长的目的基因序列，并能够将目的基因整合入宿主细胞基因，使目的基因在靶细胞中获得持续高效稳定表达[19-20].本研究在使用慢病毒重组质粒成功转染293T细胞的基础上，选取两株前列腺癌细胞构建hAT2R基因过表达细胞系，并使用RT-PCR定量检测及Western blot分别检测重组细胞系中目的基因hAT2R在基因及蛋白质水平的表达，同时使用CGP42112检测了重组细胞系的受体功能，检测结果证明重组细胞系构建成功，PC-3-hAT2R、DU145-hAT2R两株重组细胞系为进一步研究C21及非特异性AT2R激动剂对前列腺癌细胞的作用及其机制提供了可靠便捷的工具.

综上，本研究成功构建了hAT2R过表达稳定细胞系，为研究AT2R激动剂C21等对前列腺癌的作用及机制提供实验基础.