Six4蛋白在结肠癌中的表达及临床意义

莫惠婷，蔡红兵，宋姗姗，涂维，罗荣城

(南方医科大学 中西医结合医院， 广东 广州 510315)

结肠癌(colorectal carcinoma,CRC)是最常见的消化道肿瘤之一，随着社会的发展、人民生活及饮食习惯的改变，结肠癌的发病率及死亡率不断上升[1-2].国家癌症中心分析，我国男性和女性结肠癌发病率分别为10.46%和9.17%，死亡率在男性中排名第4、女性中排名第5[3].虽然目前对结肠癌有多方法联合治疗，结肠癌患者术后仍有约50%可能出现肿瘤转移[4]，总生存时间不能令人满意.寻找特异基因及特定靶点成为结肠癌早期诊断、靶向治疗的新方向.

研究表明Six4基因表达与食管鳞癌[5]、乳腺癌[6]、膀胱癌[7]、非小细胞肺癌[8]等多种肿瘤的发生发展、侵袭转移及预后有紧密关系，提示Six4基因可能作为多种肿瘤的致癌基因.但有关Six4蛋白的表达与结肠癌患者的临床特征及生存时间的关系少有报道，本研究通过检测Six4蛋白在结肠癌中的表达情况，探索其与结肠癌临床特征及预后的相关关系.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织芯片

采用从上海芯超生物科技有限公司购买的组织芯片，该芯片包含生存期结肠癌93例，手术时间为2009年11月至2010年5月，癌/癌旁各1个点，共87例，只有癌组织1个点，共6例，合计93例.其中男52例，女41例，年龄23～93岁，平均年龄66.67岁.所有的标本都请病理科医生进行独立的诊断与评估.

1.1.2 主要试剂

一抗为兔抗人Six4抗体(Signalway Antibody公司产品)、小鼠/兔链霉卵白素-生物素法检测系统(通用SP试剂盒SP-9000))、乙二胺四乙酸二钠 (ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)抗原修复液(pH=9.0,20倍)、PBS(浓度为0.01 mmol/L，pH=7.4)、DAB显色剂(dako REALTM EnVisionTM detection system, peroxidase/DAB+, rabbit/mouse).

1.2 方法

1.2.1 人结肠癌基因芯片数据库分析

对医学癌症数据库(the cancer genome atlas,TCGA)的结肠癌病理资料进行预后分析，采用Kaplan-Meier生存曲线分析Six4表达与总生存时间的关系，log-rank检验分析生存曲线的差异，以P<0.05为有统计学差异.从TCGA数据库提取结肠癌及癌旁组织中的Six4表达相关信息，通过Mann-WhitneyU检验分析癌与癌旁的表达的统计学差异.

1.2.2 SP免疫组化法染色

参照文献[5]的免疫组化方法，Six4一抗(V一抗∶V抗体稀释液=1∶200)稀释过夜，次日DAB显色后，苏木素染核、分化、封片，镜下观察评分.

1.2.3 结果判定

Six4蛋白主要表达于腺体细胞的细胞质及细胞膜，以细胞质及细胞膜出现淡黄色、黄色、棕黄色为阳性.按阳性细胞比例计分：<10%为0分，10%～30%为1分，31%～60%为2分，>60%为3分；按染色强度计分：无色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分.将两项计分相乘：乘积≤3为Six4表达阴性(-)，>3为Six4表达阳性(+).

1.2.4 统计学处理

采用SPSS 20.0统计分析软件对数据进行处理，以P<0.05为有统计学差异.

2 结果

2.1 Six4基因高表达与结肠癌患者不良预后相关

从TCGA数据库中选取370例结肠癌患者的Six4和生存时间信息，对数据进行Kaplan-meier生存分析(图1)，结果显示Six4高表达组的生存时间比Six4低表达组显著缩短(P=0.002).

图1 Six4表达水平与结肠癌患者总生存期的关系曲线

Fig.1 Curve of relationship betweenSix4expression level and total survival of patients with colorectal carcinoma

2.2 Six4基因在结肠癌组织中高表达

从TCGA数据库中提取结肠癌及癌旁组织中的Six4表达信息，Mann-WhitneyU检验分析显示在结肠癌组织中的Six4表达较癌旁组织显著增高(P<0.001)(图2).利用免疫组化检测组织芯片中87例结肠癌及相应癌旁组织，6例单独结肠癌组织中Six4的表达情况.Six4表达定位于细胞浆及细胞膜(图3).在结肠癌组织中，有49例患者Six4蛋白高表达，44例患者低表达，而在结肠癌癌旁组织中，79例患者Six4蛋白低表达，只有8例高表达(表1)，2统计分析显示，Six4蛋白在结肠癌组织中表达(52.7%)显著高于癌旁组织(9.2%)，P<0.001，可见Six4蛋白在结肠癌组织中表达显著升高(表1).

图2 结肠癌组织与癌旁组织中Six4的表达水平

Fig.2 The expression of Six4 in colon cancer tissues and adjacent tissues

表1 Six4在结肠癌组织与癌旁组织的表达水平

2.3 Six4蛋白与结肠癌患者临床病理特征之间的关系

本研究发现在93例结肠癌组织中，Six4蛋白的表达与病理分期(P=0.020)、肿瘤大小(P=0.034)、MSH6表达水平(P=0.035)呈正相关，病理分期较晚、肿瘤体积较大、MSH6高表达的患者Six4表达显著升高.与性别、年龄、淋巴结转移、远处转移、TNM分期、Ki67表达水平、P53表达水平、MSH2表达水平等无明显相关性(表2).

2.4 Six4表达是结肠癌患者预后的独立因素

组织芯片数据用COX单因素回归分析结果显示，病理分期(P=0.001)、肿瘤大小(P=0.011)、淋巴结转移(P=0.000)、TNM分期(P=0.001)及Six4的表达(P=0.028)与结肠癌患者的生存时间呈显著相关性.为了确定Six4是否为结肠癌的独立预后因子，将病理分期、肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期、MSH6纳入多因素回归分析，结果显示Six4的表达水平(P=0.029)可以作为结肠癌患者的独立预后因素.

表2 Six4在结肠癌中的表达与临床特征的关系

Table 2 Relationship between clinical characteristics and Six4 levels in individuals with colorectal carcinoma

nSix4(n=49)(n=44)P5223290.065412615/<654221210.637≥655128238947420.912422ⅠⅡ7837410.020Ⅱ～ⅢⅢ15123d/mm<53413210.034≥55936235024260.912432518TNMⅠ&Ⅱ4621250.178Ⅲ&Ⅳ472819KI675027230.784432221P534422220.622492722MSH2161060.387773938MSH63825130.035552431

表3 总生存时间的单因素和多因素Cox分析Table 3 Summary of univariate and multivariate Cox regression analysis of OS

3 讨论

结直肠癌的发病与结肠息肉病、慢性溃疡性结肠炎、高脂肪和低纤维素饮食习惯及遗传因素等多种因素有关.结肠癌的病因及发病机制尚不完全清楚，最新的研究全基因组关联研究结果显示40种新的与结肠癌的风险增加有关的遗传变异[9]，可见其发生、发展及侵袭转移是一个极其复杂的过程，需要多阶段、多步骤及多基因的参与[10].

同源异性框基因家族(homebox gene)是一类高度保守的DNA序列，根据其同源异形域(homeo-domain，HD)差异和额外序列不同，分为Hox、Msx、Pax、Six等几个不同家族，在生物发育和分化中起到重要的调控作用，是一种在进化上高度保守的基因序列，可特异性地调控相应基因的表达，具有特定的时空表达模式.有报道指出，同源异形框基因与细胞恶变、恶性增殖、出现侵袭、转移特性相关，可能促进肿瘤的发生发展[11].

Six家族共有6种不同基因[12]，当6个基因异常表达可促进细胞异常增殖、血管生成、侵袭和迁移而促进肿瘤发生、肿瘤进展.Six1可促进非小细胞肺癌增殖和侵袭，Six2可通过转录调节结肠癌细胞中ZEB1表达进而促进上皮间质转化，与结肠癌不良预后密切相关；Six3表达上调可促进乳腺癌转移.Six4作为Six家族成员之一，编码的蛋白作为转录因子在细胞发育分化增殖中起关键的调控作用，可调节Na+/K+-ATP酶亚基的表达[13]；另外可与Six1基因协同作用，调节参与各种器官形成的相关靶基因，包括肌肉[14]、肾脏[15]、性腺[16]、神经节[17]、味蕾[18]、嗅觉基板[19]和大脑[20].Six4基因参与到胚胎发育过程中肌纤维分化[21]，诱导ATP2A1、MYL1和TNNT3基因表达上调，进而激活肌细胞分化.同时也有研究指出Six4参与肿瘤细胞分化、侵袭、迁移等过程[22].在体外实验中验证了，Six4基因可影响肝细胞癌细胞的迁移、增殖和干性的维持.Six4是Mir-203a的直接靶点，Six4过度表达使mir-203a表达下调[7],与膀胱癌肿瘤发生密切相关.另外Six4可能是Mir-145靶基因，参与调控肺腺癌细胞增殖、侵袭等恶性能力[23].本研究利用免疫组化法对结肠癌组织芯片做Six4蛋白表达研究，结合临床特征数据分析，初步揭示了Six4蛋白在结肠癌组织中高表达，与病理分期、肿瘤大小、MSH6表达水平相关，可作为结肠癌患者独立预后因素，提示Six4表达上调可能促进结肠癌的发生发展，为进一步研究Six4基因在结肠癌中作用机制提供了实验依据.