EMS患者异位和在位内膜组织ROCK1及HOXA10的表达及其意义

王志志?冯华萍?高李炎?赵绍杰

【摘要】目的 探討子宫内膜异位症（EMS）患者异位和在位内膜组织RhoA/Rho相关激酶1（ROCK1）及同源盒A10（HOXA10）的表达及其意义。方法 收集140例EMS患者的异位和在位内膜组织进行ROCK1及HOXA10表达的免疫组织化学染色（免疫组化）与蛋白免疫印迹法检测，分析患者的临床特征与上述2种蛋白表达水平之间的关系。结果 EMS患者异位内膜组织的 ROCK1表达阳性率为77.9%，高于在位内膜组织的21.4%，异位内膜组织的HOXA10表达阳性率为28.6%，低于在位内膜组织的87.9%（P均< 0.05）。蛋白免疫印迹法显示，异位内膜组织的ROCK1相对表达强度高于在位内膜组织、HOXA10 低于在位内膜组织 （P均< 0.05）。异位内膜组织的ROCK1、HOXA10表达阳性率与EMS患者的年龄、病程、异位内膜分期均无关（P均> 0.05），而与EMS临床分期有关（P < 0.05）。ROCK1与HOXA10表达阳性率有关（P < 0.05）。结论 EMS患者的异位和在位内膜组织中ROCK1、HOXA10表达存在显著差异，推测HOXA10可负调控ROCK1信号通路，从而调节EMS的发生与发展。

【关键词】子宫内膜异位症;RhoA/Rho相关激酶1;同源盒A10;临床特征

Expression and significance of ROCK1 and HOXA10 in ectopic and eutopic endometrium of patients with endometriosis Wang Zhizhi， Feng Huaping， Gao Liyan， Zhao Shaojie. The Affiliated Wuxi Maternal and Child Health Care Hospital of Nanjing Medical University， Wuxi 214002， China

Corresponding author， Zhao Shaojie

【Abstract】Objective To investigate the expression and significance of ROCK1 and HOXA10 in ectopic and eutopic endometrium of patients diagnosed with endometriosis （EMS）.  Methods One hundred and forty patients with EMS admitted to our hospital were enrolled in this study. The ectopic and eutopic endometrial tissues of 140 patients were collected for ROCK1 and HOXA10 expression detected by immunohistochemical staining and Western blot. The relationship between the clinical characteristics and the expression levels of ROCK1 and HOXA10 proteins was analyzed.  Results In the ectopic endometrium， the positive rate of ROCK1 was 77.9%， significantly higher than 21.4% in the eutopic endometrium （P < 0.05）， whereas the positive rate of HOXA10 was 28.6%， considerably lower than 87.9% in the eutopic endometrium （P < 0.05）. Western blot revealed that the relative expression of ROCK1 in the ectopic endometrium was significantly higher， whereas the relative expression of HOXA10 was remarkably lower than those in the eutopic endometrium （both P < 0.05）. In the ectopic endometrium， the positive rates of ROCK1 and HOXA10 were not significantly correlated with the age， course and staging of ectopic endometrium （all P > 0.05）， whereas were significantly associated with the clinical staging of EMS （P < 0.05）. Association analysis of categorical variables showed that the positive rate of ROCK1 was correlated with that of HOXA10 （P < 0.05）.  Conclusions The expression levels of ROCK1 and HOXA10 significantly differ between the ectopic and eutopic endometrial tissues of EMS patients. It is speculated that HOXA10 can negatively regulate the ROCK1 signaling pathway， thereby regulating the incidence and development of EMS.

【Key words】Endometriosis;ROCK1;HOXA10;Clinical characteristics

子宫内膜异位症（EMS）是一种具有侵袭、复发、种植等生物学行为的妇科常见病，异位内膜细胞能够在宫腔外种植并存活[1]。EMS的发病机制还未完全清楚，有研究表明在EMS中有许多同源盒（HOX）基因存在异常表达[2]。HOX基因在果蝇体内具有高度的时空特异性，也存在于酵母及人类的几乎所有真核细胞中，包含了183个核苷酸序列组成的保守碱基序列，能编码61个氨基酸的多肽[3]。HOXA10基因是HOX家族的重要成员，属于B型腹型HOX基因亚家族，可参与正常月经周期子宫内膜的增生和分化，其是控制女性生殖道发育、胚胎细胞植入和增殖、内膜细胞发育和分化的重要基因[4]。有研究显示在整个月经周期中，HOXA10基因在子宫内膜腺体及基质均表达，且在分泌中后期及着床期表达显著增高[5]。RhoA/Rho相关激酶（ROCK）信号通道在体内普遍存在，与细胞增殖关系密切[6]。但是ROCK在EMS中的作用还没有相关报道。因此，本实验通过采用免疫组织化学染色（免疫组化）法与蛋白免疫印迹法检测ROCK1及HOXA10在EMS患者异位和在位内膜组织的蛋白表达情况，并分析它们与患者临床特征之间的相关性，从而为临床早期诊断、治疗及预后判断提供参考，现总结报告如下。

对象与方法

一、研究对象

选择2015年8月至2018年1月在我院进行腹腔镜手术治疗的140例EMS患者作为EMS组。病例纳入标准：符合EMS的诊断标准，临床表现痛经进行性加重，近3个月内未服用性激素类药物且无其他系统疾病。排除标准：原发性痛经，合并肿瘤等疾病，临床与病理资料不完善者。140例患者的年龄28 ～ 44岁、中位年龄37岁，临床分期Ⅰ期80例、Ⅱ期50例、Ⅲ期10例，异位内膜处于增生期80例、分泌期60例。本研究经医院伦理委员会批准，入组患者均已签署知情同意书。

二、方 法

1. 标本采集

腹腔镜术中刮取140例EMS患者的异位和在位内膜组织，所有组织均经病理学检查确认，将每例组织标本分为两部分，一部分行蛋白免疫印迹法，另一部分以石蜡包埋，行5 μm厚连续切片，65℃烤片2 h，置于4℃长期保存。

2. 免疫组化分析

ROCK1、HOXA10山羊多克隆抗体（1∶50，1∶100）购于美国SantaCruz公司;ElivisionTM  Plus 免疫组化试剂盒购于福州迈新生物技术开发有限公司;链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）通用型免疫组织化学试剂盒购于大连TAKARA公司。将组织切片置于66℃ 烤箱中1 h，然后放入二甲苯中脱蜡和梯度乙醇水化，再以0.01 mmol/L磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3次，每次各5 min，抗原修复后用0.01 mmol/L PBS冲洗3 次，每次各5 min，过氧化氢溶液滴于组织切片上，室温孵育10 min，清除内源性过氧化物酶活性，封闭组织内非特异性抗原，抗原抗体结合，于室温复温45 min，滴加生物素标记二抗，滴加亲和素标记辣根过氧化物酶（HRP）、二氨联苯胺（DAB）显色，苏木素复染，中性树胶封片，镜下观察。

ROCK1、HOXA10阳性指细胞胞浆呈棕黄色颗粒，根据染色强度及范围分别计分：染色范围< 5%为0分、5% ～ 20%为1分、21% ～ 50%为2分、> 50%为3分;染色程度无色为0分、淡黄为1分、棕黄为2分、棕褐为3分。两者得分乘积判定表达阳性率，累积0 ～ 1分为阴性，≥2分为阳性。

3. 蛋白免疫印迹法检测

选择兔抗人ROCK1、HOXA10单克隆抗体（购自武汉博士德公司，抗体工作浓度1∶1000，1∶200）。提取新鲜异位和在位的组織标本，加裂解液裂解，超声仪粉碎，离心分离蛋白，采用BCA法定量蛋白浓度，80 μg蛋白/泳道行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）分离总蛋白，转膜后在室温下5% 脱脂牛奶封闭2 h，分别加入一抗和内参β-肌动蛋白（β-actin），4℃ 孵育过夜，加入二抗，电化学发光法（ECL）显影。

三、统计学处理

使用SPSS 22.0分析数据。正态分布计量资料用表示，在位内膜组织与异位内膜组织间比较采用配对t检验;计数资料以例（%）表示，在位组织与异位内膜组织间比较采用配对χ2检验，不同临床特征间ROCK1、HOXA10阳性率比较采用χ2检验。分类变量相关性分析采用关联分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

结果

一、EMS患者异位和在位内膜组织的ROCK1 表达情况比较

140例EMS患者中，异位内膜组织的 ROCK1表达阳性率为77.9%，在位内膜组织的ROCK1表达阳性率为21.4%，异位内膜组织的 ROCK1表达阳性率高于在位内膜组织（χ2 = 70.124、P < 0.001）。

二、EMS患者异位和在位内膜组织的HOXA10表达情况比较

140例EMS患者中，异位内膜组织的 HOXA10表达阳性率为28.6%，在位内膜组织的HOXA10表达阳性率为87.9%，异位内膜组织的HOXA10 表达阳性率低于在位内膜组织（χ2 = 66.884、P < 0.001）。

三、EMS患者的异位和在位内膜组织ROCK1、HOXA10蛋白免疫印迹结果比较

异位内膜组织的ROCK1相对表达强度高于在位内膜组织、HOXA10 低于在位内膜组织（P均< 0.05）

四、EMS患者异位内膜组织的ROCK1、HOXA10表达阳性率与临床特征的相关性

異位内膜组织的ROCK1、HOXA10表达阳性率与EMS患者的年龄、病程、异位内膜分期均无关（P均>0.05），而与EMS临床分期有关（P<0.05），见表4。

五、EMS患者异位内膜组织的ROCK1与HOXA10表达关联分析

在EMS患者的异位内膜组织中，分类变量的关联分析显示ROCKI与HOXA10表达有关（χ2 = 4.790、P < 0.05）。

讨论

EMS是临床上的常见疾病，是指具有活性的子宫内膜组织出现在子宫以外的部位。EMS具有组织侵袭、复发、局部播散、远处转移等恶性行为，但是具体的发病机制还不明确[7]。EMS的发生被认为与许多相关基因的激活和（或）失活有关[8]。

HOX基因已经被认为与肿瘤进展与胚胎发育密切相关，在胚胎发育过程中，HOX基因在时间和空间分布上都表现出了高度的特异性，其中9 ～ 13组基因调控腰骶部发育，与生殖器官的发育密切相关[9]。HOXA10基因属于HOX基因亚家族，其N端是个富含多个脯氨酸和谷氨酰胺的区域，也为转录活性单位[10]。HOXA10通过直接调节下游基因，从而在子宫及胚胎着床过程中发挥重要作用[11]。EMS患者孕激素受体表达改变可导致孕激素反馈失调，使得孕激素敏感受体包括在位子宫内膜HOX基因表达减低[12]。ROCK属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶分子，约含有1300 个氨基酸，自N 端起有激酶催化结构域、然后是Rho蛋白结合结构域、PH结构域和一个C 末端半胱氨酸富集结构域[13]。RhoA/ROCK通路在细胞收缩、存活/凋亡、基因转录、迁移、增殖和分化中起重要作用。RhoA/ROCK活化可增加细胞对钙离子的敏感性，促进肌丝收缩，最终表现为平滑肌收缩，从而在血管的病理、生理中起重要作用[14]。本研究显示，EMS患者异位内膜组织的ROCK1相对表达强度高于在位内膜组织，HOXA10相对表达强度低于在位内膜组织。

HOXA10是子宫内膜增殖和分化的调节基因，其在EMS发病中的作用值得探讨。正常月经周期受雌激素和孕激素的变化调节，而HOXA10以激素依赖的方式在人子宫内膜组织表达;雌激素和孕激素可调节子宫内膜HOXA10基因的表达，且呈剂量依赖性[15]。HOXA10也是胚胎着床和子宫内膜蜕膜化不可缺少的基因，表达于人的整个月经周期，在分泌中期至晚期呈现高表达状况，且间质高于腺体。由于HOX 基因的表达被认为是随着子宫内膜的分化而发生变化，为此HOX基因的表达也会影响子宫内膜增生或恶性肿瘤的发展。RhoA 是小分子G 蛋白Rho亚家族中研究最深入的成员之一，ROCK是RhoA蛋白下游最主要的效应分子[16]。ROCK的下游靶分子包括肌球蛋白轻链磷酸酶、ERM家族蛋白、肌球蛋白、内收蛋白等，随着宫颈癌恶性程度增高，ROCK蛋白表达水平也增高，提示ROCK信号通道的激活与宫颈癌的恶性进展密切相关[17]。本研究显示在异位内膜组织中，ROCK1、HOXA10表达阳性率与患者的年龄、病程、疾病类型无关，而与临床分期有关;分类变量的关联分析显示ROCK1与HOXA10表达有关。当前有研究表明，HOX基因通过与其下游靶基因的调控区域结合，从而激活或抑制转录，其中HOX10基因是通过与ROCK1基因结合形成二聚体来发挥作用[18]。也有研究显示，机械刺激可通过RhoA/ROCK信号通路介导PI3K/Akt信号的活化，从而调控下游HIF-1α、VEGF的表达，参与EMS的发生与发展[19]。

综上所述，EMS患者异位和在位内膜组织的ROCK1、HOXA10表达存在差异，HOXA10可能通过调控ROCK1信号通路，从而影响EMS的发生与发展。

参 考 文 献

[1] 朱静妍，朱秀君， 黄黛苑， 陈颐， 陆杉， 梁雪芳， 黄健玲， 徐珉. 子宫内膜异位症的发病相关因素研究.新医学，2014，45（11）：724-728.

[2] Ji F， Yang X， He Y， Wang H， Aili A， Ding Y. Aberrant endo-metrial DNA methylome of homeobox A10 and catechol-O-methyltransferase in endometriosis. J Assist Reprod Genet，2017，34（3）：409-415.

[3] Guo SW， Zhang Q， Liu X. Social psychogenic stress promotes the development of endometriosis in mouse. Reprod Biomed Online，2017，34（3）：225-239.

[4] Zhang Q， Liu X， Guo SW. Progressive development of endom-etriosis and its hindrance by anti-platelet treatment in mice with induced endometriosis. Reprod Biomed Online，2017，34（2）：124-136.

[5] Zhu B， Chen Y， Shen X， Liu X， Guo SW. Anti-platelet therapy holds promises in treating adenomyosis： experimental evidence. Reprod Biol Endocrinol，2016，14（1）：66.

[6] Long Q， Liu X， Qi Q， Guo SW. Chronic stress accelerates the development of endometriosis in mouse through adrenergic receptor β2. Hum Reprod，2016，31（11）：2506-2519.

[7] Guo SW， Ding D， Liu X. Anti-platelet therapy is efficacious in treating endometriosis induced in mouse. Reprod Biomed Online，2016，33（4）：484-499.

[8] Zhang Q， Duan J， Liu X， Guo SW. Platelets drive smooth muscle metaplasia and fibrogenesis in endometriosis through epithelial-mesenchymal transition and fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation. Mol Cell Endocrinol，2016，428：1-16.

[9] 李再儀，游泽山，余凤花， 邱艺.未累及卵巢的盆腔子宫内膜异位病灶电灼术对患者血清AMH水平及卵巢储备功能的影响.新医学，2017， 48（11）：804-807.

[10] Liu X， Long Q， Guo SW. surgical history and the risk of endo-metriosis： a hospital-based case-control study. Reprod Sci，2016，23（9）：1217-1224.

[11] Goetz LG， Mamillapalli R， Taylor HS. Low body mass index in endometriosis is promoted by hepatic metabolic gene dysre-gulation in mice. Biol Reprod，2016，95（6）：115.

[12] Guo SW， Du Y， Liu X. Platelet-derived TGF-β1 mediates the down-modulation of NKG2D expression and may be responsible for impaired natural killer （NK） cytotoxicity in women with endometriosis. Hum Reprod，2016，31（7）：1462-1474.

[13] Zhang Q， Duan J， Olson M， Fazleabas A， Guo SW. Cellular changes consistent with epithelial-mesenchymal transition and fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation in the progression of experimental endometriosis in baboons. Reprod Sci，2016，23（10）：1409-1421.

[14] Sun Q， Ding D， Liu X， Guo SW. Tranylcypromine， a lysine-specific demethylase 1 （LSD1） inhibitor， suppresses lesion growth and improves generalized hyperalgesia in mouse with induced endometriosis. Reprod Biol Endocrinol，2016，14：17.

[15] Parasar P， Sacha CR， Ng N， McGuirk ER， Chinthala S， Ozcan P， Lindsey J， Salas S， Laufer MR， Missmer SA， Anchan RM. Differentiating mouse embryonic stem cells express markers of human endometrium. Reprod Biol Endocrinol，2017，15（1）：52.

[16] van Aken M， Oosterman J， van Rijn T， Ferdek M， Ruigt G， Kozicz T， Braat D， Peeters A， Nap A. Hair cortisol and the relationship with chronic pain and quality of life in endometriosis patients. Psychoneuroendocrinology，2018，89：216-222.

[17] Chandra A， Rho AM， Jeong K， Yu T， Jeon JH， Park SY， Lee SR， Moon HS， Chung HW. Clinical experience of long-term use of dienogest after surgery for ovarian endometrioma. Obstet Gynecol Sci，2018，61（1）：111-117.

[18] Khandia R， Munjal A， Dhama K， Malik YS. Bacterial toxins： a hope towards angiogenic ailments. Curr Drug Metab，2017，18（10）：926-941.

[19] 陈玉清，常亚杰，杨欢.重度宫腔粘连子宫内膜修复中微血管密度及VEGF的表达及其临床意义. 新医学， 2016， 47（10）：671-675.

（收稿日期：2019-03-28）

（本文编辑：林燕薇）