二甲双胍对鸡巨噬细胞HD11天然免疫相关基因表达影响及其抗禽白血病病毒能力分析

豆春峰，王 芳，胡序明，欧阳娟，陈世豪，贾崇信，薛松磊，徐 慧，齐田羽，耿拓宇，崔恒宓,4,5,6

（1.扬州大学表观遗传学及表观基因组学研究所，扬州225009；2.扬州大学动物科学和技术学院，扬州225009；3. 扬州大学兽医学院，扬州225009；4.扬州大学比较医学研究院，扬州225009；5.江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州225009；6.教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室，扬州225009）

自从1957年上市以来，二甲双胍（metformin）应用于Ⅱ型糖尿病临床治疗已有60年的历史[1]。二甲双胍是AMPK-LKB1信号通路的激活剂[2]，可以在肝细胞、骨骼肌细胞、胰岛β细胞和神经细胞内抑制线粒体呼吸链复合体I即NADH-Q氧化还原酶的作用[3]，造成线粒体生物氧化功能减弱，从而激活单磷酸腺苷依赖的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）的氧化磷酸化。AMPK一旦被激活，即可抑制糖类、脂肪和蛋白质合成，刺激脂肪酸的氧化和肝脏组织对葡萄糖的吸收利用，维持能量代谢平衡[4]。二甲双胍还可通过降低胰岛素和胰岛素结合蛋白水平来间接降低IGF-1水平，进而产生抗肿瘤细胞增殖作用[5]。近年来，针对二甲双胍临床价值的研究越来越多，新的作用也不断被发现。慢性丙型肝炎病毒感染者在接受二甲双胍、IFN-α和利巴韦林联合治疗时，持续病毒学应答比率（sustained virological response，SVR）增加[6]。Tsai等[7]研究表明二甲双胍可通过AMPK途径来激活I型干扰素抗病毒信号通路（type I IFN antiviral pathway），并且可以抑制丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）的复制。

禽白血病是由禽C型反转录病毒群禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）引发的多种肿瘤性疾病的统称。根据ALV中和反应类型、宿主范围、囊膜特性等将其划分为A到J 10个亚群[8]。J 亚群ALV（ALV-J）是20世纪80年代末期新发现的白血病病毒的新亚群，可引起骨髓样细胞瘤为主的白血病[9]。常维山等[10]在2007～2009 年调查发现，很多地区蛋鸡发病鸡群中白血病发病率为5%～20%。ALV可经蛋由亲代向子代发生垂直传播，子代可对ALV产生免疫耐受，但也可成为重要传染源，通过垂直传播形成代代相传[11]。水平传播也是ALV重要的传播方式。ALV可引起感染鸡群生产性能下降，达不到预期产蛋率，蛋品质降低[12]。此外，禽白血病也可影响T、B淋巴细胞的成熟及分化，引起鸡群的免疫抑制[13]，继发多种免疫抑制病，使其更易受到细菌和病毒的感染。

ALV在畜牧兽医上日益受到重视，如果验证二甲双胍具有抑制ALV增殖的作用，那么将在家禽业的疾病防控中具有很高的应用价值。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料1640培养基、DMEM培养基、新生牛血清FBS和0.25%胰蛋白酶均购自GIBCO公司；反转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 和荧光染料试剂SYBR Premix ExTaqⅡ购自日本TaKaRa公司；其他试剂均为国产分析纯；鸡巨噬细胞HD11和J亚群禽白血病病毒ALV-J由扬州大学焦新安教授馈赠。

1.2 细胞培养使用含有1%双抗和10%胎牛血清的1640培养基，在41℃、5% CO2培养箱中对鸡巨噬细胞系HD11进行培养。

1.3 药物处理和病毒感染将鸡巨噬细胞HD11接种至6孔细胞培养板，用2 mmol/L 二甲双胍对细胞进行处理，设置对照，48 h后收集HD11细胞用于RT-qPCR检测。将鸡巨噬细胞HD11细胞接种至6孔细胞培养板，然后将ALV-J接种于细胞孔中（MOI=5）。病毒感染细胞24 h后进行二甲双胍药物处理。RT-qPCR检测引物根据GenBank公布的序列，采用Primer premier 6.0软件设计并委托Invitrogen公司合成（表1）。

表1 荧光定量PCR检测引物Table 1 Primers for RT-qPCR

1.4 总RNA提取、反转录和RT-qPCR采用Trizol法提取经药物处理48 h的细胞总RNA，用反转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser将1 μg总RNA反转录成cDNA，经稀释后通过CFX ConnectTM荧光定量 PCR 检测系统进行定量分析。反应体系：cDNA 模板1 μL、SYBR Green II 10 μL、上下游引物各2 μL、超纯水4.6 μL。反应条件：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火34 s，40个循环。TLR3、IFIH1、IRF7、IFN-α、IFN-β、STAT1、ALVE1、EAV-HP和Ovex1 为检测基因，GAPDH和β-actin基因作为内参。

1.5 酶联免疫吸附剂测定采用IDEXX公司提供的ALV抗原抗体检测试剂盒对ALV-J感染上清进行ELISA检测。首先取出抗体包被板，分别加入未经稀释的阴性对照、阳性对照和待检样品，室温孵育1 h；洗涤3次后加入辣根过氧化物酶标记的（兔）抗p27抗体，室温孵育1 h；洗涤3次后每孔加入TMB底物溶液，室温孵育15 min，加入终止液，终止反应。最后，通过酶标仪测定A650。

1.6 统计分析和作图统计分析和作图采用SPSS软件（version 16.0）和GraphPad（Prism 5）软件进行。所有数据以±s表示，P＜0.05表示差异具有显著统计学意义，P＜0.01表示差异具有极显著统计学意义。

2 结果

2.1 二甲双胍处理后天然免疫相关基因表达变化对鸡巨噬细胞HD11进行二甲双胍处理48 h后，采用RT-qPCR检测天然免疫相关基因TLR3、IFIH1、IRF7、STAT1、IFN-α和IFN-β表达情况。结果显示这些基因的表达显著上调（图1）。与对照组相比，STAT1表达差异具有显著统计学意义（P＜0.05，FC＞2），其余基因表达差异均具有极显著统计学意义（P＜0.01，FC＞2）。这些基因均在抗病毒天然免疫中发挥着关键作用，因此，二甲双胍可能通过激活天然免疫以发挥抗病毒功能。

图1 二甲双胍处理HD11细胞后天然免疫相关基因表达变化（**P＜0.01,*P＜0.05）Fig.1 Effects of metformin on the expression of innate immune-related genes in HD11(**P＜0.01,*P＜0.05)

2.2 二甲双胍处理后内源性反转录病毒表达变化用2 mmol/L二甲双胍处理HD11细胞48 h后，采用RT-qPCR检测内源性病毒ALVE1、EAV-HP和Ovex1表达情况。结果显示，与对照组相比，二甲双胍处理HD11细胞48 h后激活了鸡内源性反转录病毒ALVE1、EAV-HP和Ovex1表达，且表达差异具有极显著统计学意义（P＜0.01）（图2）。

2.3 二甲双胍处理对病毒增殖的影响ALV-J病毒感染HD11细胞24 h后进行二甲双胍处理，48 h后分别收集细胞和病毒上清进行检测。RT-qPCR结果显示，二甲双胍抑制了ALV-Jenv基因的转录表达，差异具有极显著统计学意义（P＜0.01）（图3A）。ELISA结果显示，二甲双胍处理48 h抑制了ALV-J p27蛋白（ALV-Jgag基因产物）的表达，差异具有显著统计学意义（P＜0.05）（图3B）。

图2 二甲双胍处理HD11细胞后内源性反转录病毒表达变化（**P＜0.01）Fig.2 Effects of metformin on the expression of endogenous virus in HD11(**P＜0.01)

图3 二甲双胍处理HD11细胞后病毒复制水平变化（**P＜0.01,*P＜0.05）Fig.3 Effects of metformin on the virus replication in HD11(**P＜0.01,*P＜0.05)

3 讨论

ALV是在畜牧兽医上日益受到重视的一种病原体，但由于目前尚无有效的疫苗和特效药物来控制鸡群感染，只能通过选育抗病品系来控制发病率或者通过鸡场种群净化来淘汰感染鸡群[10]。二甲双胍不仅可以治疗糖尿病，还具有抑制肿瘤、抗衰老等作用。本研究在鸡巨噬细胞HD11中观察到，二甲双胍可以显著抑制ALV-J的增殖，说明二甲双胍具有抗病毒的功能。巨噬细胞是一种天然的免疫细胞，是研究抗病毒功能的理想细胞。。

二甲双胍可能通过AMPK途径来激活HD11的某些天然免疫信号通路来抑制ALV的增殖。研究表明，二甲双胍可通过激活AMPK来激活I型干扰素抗病毒信号通路[7]。本研究发现二甲双胍诱导了一系列与抗病毒天然免疫相关基因的表达：TLR3、IFIH1、IRF7、STAT1、IFN-α和IFN-β，其中IFN-α和IFN-β都属于I型干扰素。干扰素（interferon，IFN）是由病毒和其他一些干扰素诱导剂，刺激巨噬细胞、淋巴细胞以及体细胞所产生的一种糖蛋白，具有免疫调节、抗病毒和诱导分化的作用。它与细胞靶受体结合，诱导抗病毒蛋白（antiviral protein, AVP）的生成，抑制病毒的增殖[14]。TLR3是鸡体识别RNA病毒的主要识别受体，与其特异性配体结合后，启动鸡体内天然免疫的信号级联传导，从而诱导抗病毒物质产生[15]。

二甲双胍的抗病毒机制也可能与激活内源性反转录病毒，从而激活细胞天然免疫有关。研究发现二甲双胍显著激活了内源性反转录病毒（endogenous retrovirus，ERV）的表达。某些内源性反转录病毒在不同的哺乳动物基因组中可作为干扰素诱导基因的增强子，调节临近干扰素诱导基因的表达[16]。研究表明，ERV与细胞天然免疫密切相关，具有保护细胞免受感染的作用。ERV激活表达可能会产生某些dsRNA、lncRNAs或蛋白质，它们具有一些病毒特征，从而被宿主天然免疫系统识别[17]。有研究表明，ERV衍生的长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）可作为Toll样受体和天然免疫作用的调节因子[18]，参与抗病毒反应。

本研究结果表明二甲双胍具有抗病毒作用，其抗病毒机制可能与细胞天然免疫应答的激活和内源性反转录病毒有关。二甲双胍处理可以显著激活鸡巨噬细胞HD11的天然免疫应答，从而抑制禽白血病病毒在巨噬细胞中的复制水平。如果二甲双胍抑制ALV增殖可以进一步在体内实验中被加以验证，将给禽白血病的治疗带来新的曙光。