超高效液相色谱串联质谱法测定滴眼剂中6种抑菌剂含量

肖瑶 杨梅 陈红

(成都市食品药品检验研究院，成都 610045)

滴眼剂是指由原料药物与适宜辅料制成的供滴入眼内的无菌液体制剂[1]。国内滴眼剂常为多剂量制剂，开瓶后一般可使用4周，加入适当抑菌剂是保证安全使用的关键。通过分析国内滴眼剂说明书发现，仅部分说明书标注了所用抑菌剂种类，而标明其含量的则更少。本试验收集样品40批，包括抗生素滴眼液、抗病毒滴眼液、缓解视疲劳滴眼液等，主要含抑菌剂为羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、苯甲酸、山梨酸和硫柳汞。

目前，滴眼剂中抑菌剂的检查方法常为HPLC法，待测滴眼剂种类较少，且不同滴眼剂测定方法不一致，测定的抑菌剂种类也较少[2]。为了高通量快速分析各种滴眼剂中的抑菌剂，本试验建立了UPLC/MS/MS法定量分析滴眼剂中6种抑菌剂(羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、苯甲酸、山梨酸和硫柳汞),有助于快速筛查滴眼剂所含抑菌剂种类及定量。

1 仪器与试药

Waters ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪(美国Waters公司)，Waters Xevo TQ MS串联质谱仪(美国Waters公司)，Milli-Q纯水器(美国Millipore公司)。

羟苯甲酯(含量99.6%，批号：100278-201103)，羟苯乙酯(含量99.9%，批号：100847-201604)，羟苯丙酯(含量99.6%，批号：100444-201102)，苯甲酸(含量100.0%，批号：100419-201302)，均来源于中国食品药品检定研究院；山梨酸(含量99.4%，批号：40124)，硫柳汞(含量99.2%，批号：40707)，均来源于德国Dr.Ehrenstorfer GmbH。甲醇、甲酸为色谱纯市售试剂，其余试剂试药为分析纯；试验用水为Milli-Q水。样品为市售滴眼剂。

2 实验方法

2.1 液相色谱-质谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1mm×100mm, 1.7μm)；柱温：40℃；进样量：10μL；流速：0.4mL/min；流动相A：含0.05%甲酸的2.5mmol/L醋酸铵溶液，流动相B：乙腈，梯度洗脱条件见表1。

离子源及扫描方式：电喷雾离子源(ESI)，负离子模式，多反应监测(MRM)；电离电压：3.5kV；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：400℃；脱溶剂气流量：550L/h(氮气)；锥孔反吹气流量：50L/h(氮气)；碰撞室压力：4.01×10-3mbar(碰撞气为氩气)[3-4]。6种抑菌剂MRM参数见表2。

表1 超高效液相色谱梯度洗脱条件Tab.1 Gradient mobile phase for UPLC

2.2 溶液配制

供试品溶液的制备：对于含尼泊金酯类的样品，精密移取100μL，加水稀释至50mL，摇匀，作为供试品溶液；对于含苯甲酸的样品，精密移取100μL，加水稀释至1mL，摇匀，作为供试品溶液；对于含山梨酸的样品，精密移取100μL，加水稀释至10mL，摇匀，作为供试品溶液；对于含硫柳汞的样品，精密移取100μL，加水稀释至1mL，摇匀，作为供试品溶液。

对照品溶液的制备：分别精密称取6种抑菌剂对照品适量，加甲醇制成浓度约为1mg/mL的贮备液。分别精密量取羟苯甲酯、羟苯乙酯贮备液适量，加水稀释，制成浓度为500、200、50、20、10和2ng/mL的标准曲线溶液；精密量取羟苯丙酯贮备液适量，加水稀释，制成浓度为500、200、100、80、50和20ng/mL的标准曲线溶液；精密量取苯甲酸贮备液适量，加水稀释，制成浓度为25、10、2.5、1、0.5和0.1μg/mL的标准曲线溶液；精密量取山梨酸贮备液适量，加水稀释，制成浓度为100、40、10、4、2和0.4μg/mL的标准曲线溶液；精密量取硫柳汞贮备液适量，加水稀释，制成浓度为10、8、5、2.5、1和0.75μg/mL的标准曲线溶液。

3 方法学验证

3.1 专属性试验

取不含抑菌剂的空白样品溶液，按“2.1”项下色谱质谱条件试验，基质无干扰。另取不含抑菌剂的样品作为空白溶液，加入适量羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、苯甲酸、山梨酸、硫柳汞对照品，按“2.1”项下色谱质谱条件试验，在全扫描模式下的总离子流色谱图见图1，定量离子对MRM色谱图见图2。羟苯甲酯、苯甲酸、山梨酸保留时间约0.9min，羟苯乙酯保留时间约1.1min，羟苯丙酯保留时间约1.3min，硫柳汞保留时间约1.4min。在MRM模式下6种抑菌剂能良好分离，测定无干扰。

表2 6种抑菌剂MRM参数Tab.2 The parameters of MRM of six preservatives

3.2 线性与范围

精密量取“2.2”项下标准曲线溶液各10μL，按“2.1”项下色谱质谱条件，注入超高效液相色谱-质谱联用仪，以峰面积(y)为纵坐标，浓度(x)为横坐标，进行线性回归。结果表明，羟苯甲酯、羟苯乙酯在0.002～0.5μg/mL范围内、羟苯丙酯在0.02～0.5μg/mL范围内、苯甲酸在0.1～25μg/mL范围内、山梨酸在0.4～100μg/mL范围内、硫柳汞在0.75～10μg/mL范围内，峰面积与检测浓度之间的线性关系良好(r≥0.995)(表3)。

图1 空白样品加标总离子流色谱图Fig.1 TIC of the spiked sample

图2 6种抑菌剂定量离子对MRM色谱图Fig.2 MRM chromatograms of quantitative ion pairs of six preservatives

表3 6种抑菌剂线性结果Tab.3 The results of linear regression of six preservatives

3.3 回收率试验

取不含抑菌剂的空白溶液9份，按“2.2”项下制备低、中、高3种浓度的溶液，各3份，按“2.1”项下色谱质谱条件，注入超高效液相色谱-质谱联用仪，依法测定，计算回收率，羟苯甲酯平均回收率100.0%(RSD=4.0%)、羟苯乙酯平均回收率103.8%(RSD=3.4%)、羟苯丙酯平均回收率94.7%(RSD=4.1%)、苯甲酸平均回收率96.8%(RSD=3.0%)、山梨酸平均回收率105.0%(RSD=4.1%)、硫柳汞平均回收率104.7%(RSD=2.3%)。

3.4 定量限

取不含抑菌剂的空白溶液，加入各对照品溶液适量，按“2.2供试品溶液的制备”项下操作，按“2.1”项下色谱质谱条件，注入超高效液相色谱-质谱联用仪，按信噪比S/N≥10计算定量限。带入稀释倍数后，滴眼剂样品中羟苯甲酯、羟苯乙酯的定量限为1μg/mL；羟苯丙酯的定量限为10μg/mL；苯甲酸的定量限为1μg/mL；山梨酸的定量限为40μg/mL；硫柳汞的定量限为8μg/mL。

3.5 进样重复性

取“2.2”项下各对照品溶液重复进样6次，计算峰面积RSD。羟苯甲酯(进样浓度0.2μg/mL)为1.1%；羟苯乙酯(进样浓度0.2μg/mL)为2.1%；羟苯丙酯(进样浓度0.2μg/mL)为2.1%；苯甲酸(进样浓度10μg/mL)为1.5%；山梨酸(进样浓度40μg/mL)为1.7%；硫柳汞(进样浓度2.5μg/mL)为2.2%。

3.6 样品测定

采用建立的方法对42批滴眼液进行检测，测定结果见表4。

4 讨论

相同浓度下，羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、苯甲酸、山梨酸在负离子模式下的响应均强于正离子模式，故选择负离子模式进行检测。硫柳汞分子量为405.99，失钠后为383，本试验以[M-Na]-为母离子采用负离子模式进行分析。

本次试验样品批次中有35%样品未标示抑菌剂种类，标示抑菌剂种类的样品中有29%无抑菌剂标示量。而中国药典2015年版四部[1]和美国药典[5]均要求多剂量眼用制剂应在产品标签标明抑菌剂种类和标示量。由此可见应加强规范企业说明书。

本次试验中发现部分滴眼液中抑菌剂实测百分含量偏低，分析原因可能是在长期放置过程中抑菌剂存在降解的可能，导致抑菌剂检出含量低于标示量。这也与企业在滴眼剂长期稳定性研究中往往关注含量测定与有关物质检查等，未重视抑菌剂稳定性研究相关。

表4 样品测定结果Tab.4 The results of sample determination