基于1H-NMR的原发性肝癌脾虚湿盛证患者尿液代谢组学研究

王 东 李晶洁

代谢组学(metabonomics) 是研究生物体代谢活动中产生不同的内源性代谢物质，以探究机体整体性代谢变化情况及代谢途径的一门新兴学科。代谢组学的出现为生命科学的发展提供了有力的现代化实验技术手段，通过质谱、色谱、核磁共振等化学分析技术，分析不同时期或不同状态下内源性代谢产物的比例、浓度及代谢通量等变化，以找到与疾病诊断相关的标志性代谢物[1]。近年来代谢组学用于中医证型的研究取得了一定的进展，为中医病因病机、中医证型等许多方面提供微观指标的量化[2]，使中医辨证客观化目标的实现成为可能。同时，代谢组学技术不失为探寻肿瘤中医证候物质基础的较适宜的手段，本研究通过采用核磁共振氢谱检测，用代谢组学方法来探讨新疆原发性肝癌脾虚湿盛证患者的病机及特异性代谢标志物，以阐述脾虚湿盛证及非脾虚湿盛证肝癌患者体内主要代谢特征及其差异，探讨肝癌脾虚湿盛证的客观物质基础。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取新疆医科大学附属中医医院住院治疗的35例脾虚湿盛证肝癌患者作为脾虚湿盛证组，35例非脾虚湿盛证肝癌患者作为非脾虚湿盛证组，以上患者符合原发性肝癌西医诊断标准，且以原发性肝癌为第一诊断，及新疆医科大学附属中医医院体检中心体检的40例和平质健康体检者作为对照组，其中肝癌患者符合以下诊断标准及纳入标准，脾虚湿盛证患者符合以下中医证型诊断依据。三组样本基础信息见表1。

表1 三组样本基础信息

1.2 诊断标准

原发性肝癌诊断采用第八届全国肝癌学术会议上通过的《原发性肝癌的临床诊断与分期标准》[3]，所有患者均经组织学检查证实为原发性肝癌者；中医脾虚湿盛证诊断参照国家中医药管理局发布的《中医证候辨治规范》及《中医病证诊断疗效标准》[4]。

1.3 纳入标准及排除标准

①年龄>18岁；②所有纳入对象均自愿参与研究并签署知情同意书；③排除有精神障碍或严重心脑血管疾病者；④排除合并有活动性结核或严重感染性疾病患者;⑤排除妊娠期或哺乳期妇女。

1.4 检测方法

标本收集与处理：于患者入院后第二天清晨空腹采集中段尿液，并于4 ℃，3 500 r/min离心10 min，取上清液，置于-20 ℃冰箱保存备用。待全部尿液收集完成后，将样品从低温冰箱中取出并在室温中解冻，取400 μl尿液置离心管中，加入200 μl磷酸缓冲液(0.2 mol/l Na2HPO4～0.2 mol/l NaH2PO4，pH 7.4，用重水配制)，静置20 min后4 ℃,3 500 r/min离心10 min，取上清液500 μl移入5 mm核磁管中，进行核磁共振氢谱检测(proton nuclear magnetic resonance spectroscopy，1H-NMR)。

1H-NMR检测：首先对尿样采用有预饱和的1D NOESY脉冲序列，把参数设置如下：谱宽8000 Hz、混合时间0.15 s、驰豫延迟时间2 s、采样点数64 k，累加次数64次；在混合时间及驰豫延迟时间里采用预饱和方式以抑制水峰，偏置频率设置在水峰的位置。FID信号通过处理后经傅立叶变换转化为NMR图谱，所得NMR数据进行相位调整和基线校正后，对δ0.4～9.4范围内的谱图按每段δ0.01的宽度进行分段积分，积分后的数据按每张谱的总积分强度归一化，所得数据输出并转换到Excel文件保存。将Excel格式数据输入到SIMCA-P 10.0软件(瑞典，Umetrics,Umea)进行多元统计分析。

1.5 统计学分析

1H-NMR图谱进行基线校正和相位校正后检测，数据采用平均中心化(mean centering)或Pareto标度化(paretoscaling)进行预处理，再综合采用多变量统计学方法中主成分分析(principal component analysis，PCA) 、偏最小二乘判别分析(partial least square discriminant analysis，PLS-DA) 及单变量统计分析方法测定相关代谢标志物的含量。对各组患者尿液NMR谱图中检测到的代谢产物的峰面积进行双尾Welch's t test分析，以P<0.05为两组差异具有统计学意义。以下结果中数值为代谢产物色谱峰的相对强度，将谱图按0.0lppm分段积分后，以每张谱总积分值为10000进行归一化，同一谱峰积分合并后计算其所对应代谢产物的(mean±SD)。

2 结果

原发性肝癌患者尿中与机体能量代谢密切相关的肌酐含量显著较对照组健康人低(P<0.01)，且脾虚湿盛证组低于非脾虚湿盛证组(P<0.05)；而牛磺酸的含量显著高于对照组,且脾虚湿盛证组高于非脾虚湿盛证组(P<0.05)。与对照组相比肝癌患者尿中的马尿酸、氧化三甲胺(TMAO)含量下降，且脾虚湿盛证组明显低于非脾虚湿盛证组(P<0.05)。三梭酸循环的中间产物--柠檬酸，在肝癌患者尿中含量也明显低于对照组，而琥珀酸高于对照组，两者在脾虚湿盛证组与非脾虚湿盛证组比较，差异具有统计学意义。原发性肝癌患者尿中乙酸含量显著性高于对照组(P<0.05)，而在脾虚湿盛证组与非脾虚湿盛证组中比较，无统计学差异。肝癌患者尿中丙氨酸、亮氨酸、谷氨酸含量均较对照组低，且脾虚湿盛证组低于非脾虚湿盛证组(P<0.05)。 需要指出的是，以下数值为代谢产物色谱峰的相对强度，各组尿中代谢物含量变化具体见表2。

表2 各组尿样代谢物水平变化情况

注：与对照组比较，#为P<0.05；与非脾虚湿盛证组比较，*为P<0.05。

3 讨论

我们在临床上对新疆大量肝癌患者的临床诊治中，发现肝癌的主要病机是脾胃受损，酿生内湿，导致肝癌的正虚主要是脾虚，实邪主要是湿邪，这可能跟新疆地区人们的生活习惯有关[5]，新疆人恣饮烈酒，喜食膏粱厚味，口味重而多咸，这种饮食习俗容易损伤脾胃，酿生湿痰。明代《景岳全书》说：“酷饮无度，伤于酒湿，或以纵食生冷，败其真阳”脾胃损伤湿邪易侵，导致脾胃运化失职，脾虚容易驻湿，驻湿又会加重脾虚[6]，出现不停的恶性循环。其中脾虚是湿盛的原因，又是湿盛的结果，湿邪阻滞脏腑经络，易变生为癥瘕、瘀阻、积聚[7]。临床流行病学调查研究也表明：肝癌早、中、晚期不同阶段，常见有脾虚湿盛证患者。潘敏求等[8]采用频数和排序等统计分析253篇中医药治疗原发性肝癌的文献，结果表明脾虚湿困出现频率为79.07%，是中医临床辨证最常见的证型之一。凌昌全教授小组研究发现[9]，临床肝癌Ⅱ、Ⅲ期肝胆湿热、脾虚湿阻证候出现率较高，健脾化湿排毒是常用治疗大法。这些研究均说明脾虚湿盛是肝癌的主要病机,并贯穿于疾病的始终。本研究就选用新疆地区的原发性肝癌脾虚湿盛证患者作为研究对象，通过对患者尿液代谢组学研究，以探讨新疆原发性肝癌脾虚湿盛证患者的病机及特异性代谢标志物，以探寻肿瘤中医证候物质基础及使中医辨证客观化目标的实现成为可能。

代谢组学是1999 年由英国Nicholson教授及其同事提出的[10-11]，是继基因组学、转录组学及蛋白质组学之后近年来发展起来的一门新兴学科，通过对各种常见生物体内生物体液和组织代谢物进行检定和分析，把机体的代谢信息与病理生理过程相关联起来，以揭示机体的代谢本质及研究机体整体与全局[12]。目前代谢组学发展趋势用于辅助疾病的诊断与分型，如对冠心病诊断、肿瘤机制、药物的肝毒等方面的研究[13]。罗氏等[14]研究，对肝郁脾虚模型大鼠的血浆进行超导傅立叶变化核磁共振波谱仪检测，分析其代谢物的共性及生物标记物的主成分，结果发现肝郁脾虚证组大鼠的血浆乳酸、醋酸、酪氨酸、低密度脂蛋白和部分未知化合物的谱峰峰形改变较其他组明显，且随着时间的不同，代谢物谱峰也有差异，提示通过代谢组学可找到与中医证型相关联的生物学基础。Li等[15]通过MNR 技术对气虚血瘀证模型鼠的尿液代谢物进行分析，发现模型组的甲酸盐、肌酐等产物与正常组相比存有差异。动物实验亦证实不同证型大鼠血浆代谢谱之间存在差异[16]。

本研究对比了原发性肝癌患者与健康人，原发性肝癌脾虚湿盛证患者与非脾虚湿盛证患者的肌酐、牛磺酸、柠檬酸、马尿酸、琥珀酸、氧化三甲胺(TMAO)、乙酸、丙氨酸、亮氨酸、谷氨酸等含量。其中肌酐与机体能量代谢密切相关，在原发性肝癌患者尿中肌酐含量显著较对照组健康人低(P<0.01)，且脾虚湿盛证组低于非脾虚湿盛证组(P<0.05)，脾虚湿盛证患者尿液肌酐含量的减少也提示了其整体代谢水平低下。牛磺酸是胆汁酸盐的重要组成部分，主要参与脂肪的消化过程，牛磺酸水平的紊乱可能与机体脂质代谢失调有关，有研究称牛磺酸可做为肝硬化相关的代谢标记物之一[17]，在本研究中原发性肝癌患者的牛磺酸水平显著高于对照组,且脾虚湿盛证组高于非脾虚湿盛证组(P<0.05)，其提示脂类代谢水平紊乱。马尿酸是肠道菌群产生的腐败产物，而氧化三甲胺也与肠道菌群代谢有关[18]。正常情况下，肠道菌群可刺激宿主免疫功能，帮助宿主防御疾病，协助宿主消化吸收,当肠道菌群失调时，人就会出现腹泻、便秘、消化不良等症状，而马尿酸、氧化三甲胺含量的异常可反映患者肠道微生物菌群的失调[19]。本研究中，肝癌患者尿中的马尿酸、氧化三甲胺(TMAO)含量比对照组下降，且脾虚湿盛证组明显低于非脾虚湿盛证组(P<0.05)。这与该证型临床多表现为便溏、腹泻的证候相一致。同时柠檬酸、琥珀酸作为三梭酸循环的中间产物，对于机体物质代谢产生重要作用,三梭酸循环是糖类、脂类、氨基酸的最终代谢通路，是机体获得能量的主要方式，肝癌患者尿中柠檬酸含量明显低于健康人群，而琥珀酸高于健康人群，两者在脾虚湿盛证组与非脾虚湿盛证组比较，差异也具有统计学意义，由此可见，脾虚湿盛证肝癌患者出现糖代谢紊乱。另外，丙氨酸、亮氨酸、谷氨酸在生物体内的蛋白质代谢过程中占重要地位，参与生物中的许多重要化学反应[20]，而肝脏是体内氨基酸代谢的主要场所，当肝脏由于各种原因损伤时，可导致体内发生复杂的代谢紊乱，肝细胞内氨基酸代谢降低[21]。本研究中原发性肝癌患者尿中丙氨酸、亮氨酸、谷氨酸含量均较对照组低，且脾虚湿盛证组患者较非脾虚湿盛证低，提示肝癌患者尤其是脾虚湿盛证肝癌患者氨基酸分解代谢水平低下，蛋白合成不足。同时谷氨酸代谢异常易导致出现中枢疲劳，而脾虚湿盛证患者的尿液中谷氨酸含量降低，与该证型患者出现神疲懒言、体倦乏力的临床表现相一致。综上所述，对脾虚湿盛证肝癌患者尿液代谢组学研究发现，原发性肝癌患者存在糖代谢、脂类代谢、氨基酸分解代谢紊乱，且原发性肝癌脾虚湿盛证患者体内多种生命代谢的紊乱程度较非脾虚湿盛证患者严重。