LKB1蛋白在合并2型糖尿病肝癌组织中的表达和意义

罗翠松 林 云 曾志峰 将星星 时 军

肝激酶B1(LKB1)是1种肿瘤抑制基因，广泛表达于人体内的各种组织器官中，是AMPK的上游激酶，在LKBl/AMPK通路激活及下游通路的调节等方面扮演着重要角色，研究表明，LKB1表达异常与多种恶性肿瘤的发生、发展和预后相关[1-3]，但有关LKB1蛋白在合并2型糖尿病的肝癌组织中的表达情况未见报道。本研究应用免疫组化发检测合并2型糖尿病患者肝癌组织中LKB1蛋白的表达，以探讨LKB1蛋白表达与肝癌预后的关系。

1 材料与方法

1.1 标本来源

收集2007年1月至2013年3在南昌大学第一附属医院住院期间行肝癌切除、病案资料齐全且合并2型糖尿病的乙型肝炎病毒相关肝癌组织标本共计60例，其中，男性52例，女性8例；年龄35～78岁，中位年龄56岁。20例正常肝组织标本来源于同期因外伤性肝破裂住院手术患者的标本。

1.2 纳入标准和排除标准

研究对象纳入标准：①肝癌的首次治疗为接受肝癌根治性切除术；②2型糖尿病；③肝功能Child-Pugh评分A级或B级；④年龄在30～80岁；⑤术后病理诊断为肝细胞癌；⑥乙肝表面抗原阳性，丙肝抗体阴性。排除标准：①术前接受过经肝动脉化疗栓塞术、经皮肝脏局部消融治疗、放射治疗或其他全身性的抗肿瘤治疗；②合并门静脉主干及一级分支、总肝管及一级分支、肝静脉主干及下腔静脉癌栓；③有肝外转移的肝癌；④同期罹患其他器官恶性肿瘤或其他严重疾病；⑤肝癌破裂。

1.3 诊断标准和随访方法

HCC和DM的诊断标准分别符合原发性肝癌诊疗规范[4]和1999年世界卫生组织WHO糖尿病诊断标准[5]；肝细胞癌和肝硬化的诊断均由术后病理证实；结合影像学检查，将重度肝硬化定义为：肝脏形态比较规则，边缘呈小结节状和(或)轻度波浪状，质地不均匀、呈弥漫颗粒状，肝叶比例基本正常，肝裂正常或增宽[6]；肝癌复发包括肝内和肝外复发，复发定义为：CT或MRI发现的肝内外新发病灶，或者甲胎蛋白水平持续性升高。患者出院后每3个月随访一次，随访截止时间为2014年7月30日。

1.4 主要试剂

浓缩型鼠抗人LKB1单克隆抗体，工作浓度1∶150，购自STATA CRUZ公司。S-P免疫组化染色超敏试剂盒(A:内源性过氧化酶阻断剂；B:正常非免疫动物血清；C:生物素标记的第二抗体；D:链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶)，购于福州迈新生物技术开发公司。磷酸盐缓冲液PBS (0.01M,pH7.2)、柠檬酸抗原修复缓冲液(0.01M,pH6.0)和DAB显色试剂盒，购于福州迈新生物技术开发公司。

1.5 结果判定

以PBS液代替一抗作为阴性对照，以已知的阳性肝癌标本作为阳性对照。结果判断以细胞质或伴细胞核着色为阳性，根据阳性细胞所占比例及细胞染色强度进行半定量。染色分级：整张切片无阳性细胞(-)，阳性细胞<10%(+)，阳性细胞10%～50%(++)，阳性细胞>50%(+++)，数据统计时把(-)和(+)记为阴性，把(++)和(+++)记为阳性。由2位高年资病理医生在不知患者临床和病理资料情况下，依据上述标准，对免疫组化染色结果分别进行评价。

1.6 统计学方法

应用SPSS 21.0统计软件进行数据的统计分析，正态分布的计量资料用均值±标准差表示，组间比较采用t检验，非正态分布的计量资料用中位数和范围表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验。计数资料用例数(百分比)表示，组间率的比较采用χ2检验；用Kaplan-Meier法进行生存分析，两组间差异用Log-rank检验比较，采用Cox比例风险回归模型模型进行单因素和多因素分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 LKB1蛋白在正常肝组织和合并糖尿病肝癌组织中的表达

在所测60例组织中，LKB1蛋白阳性表达主要在细胞质中。正常肝组织和肝癌组织中LKB1蛋白的阳性表达率分别为100.0%(20/20)和41.7%(25/60)；肝癌组织中LKB1蛋白的阳性表达率明显低于正常肝组织，两组比较有显著性差异(χ2=20.74，P=0.00)。

2.2 LKBl蛋白表达与临床病理因素的关系

由表1可知，LKB1蛋白的表达与肝癌患者的肝硬化状态有关，合并肝硬化或重症肝硬化的HCC患者肝癌组织中的LKB1蛋白阳性表达率明显低于未合并肝硬化或重症肝硬化的肝癌组织(χ2=5.50，P=0.02；χ2=4.07，P=0.04)；LKB1蛋白的表达与性别、年龄、甲胎蛋白、血红蛋白、血小板、凝血酶原时间、白蛋白、总胆红素、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、病理分级、肿瘤直径、肿瘤数量、肿瘤包膜无关(P>0.05)。

2.3 LKB1蛋白表达与肝硬化程度相关性分析

经相关性分析发现，LKB1蛋白阳性表达与肝硬化和重度肝硬化均呈负相关性(γ=-0.30，P=0.02；γ=-0.26，P=0.04)。

2.4 LKBl蛋白表达与糖尿病相关因素的关系

由表2可知，LKB1蛋白表达与肝癌患者的糖尿病病程长短(χ2=4.21，P=0.04)和空腹血糖水平(χ2=6.86，P=0.01)有关，糖尿病病程大于5年和高血糖组的HCC患者肝癌组织中的LKB1蛋白阳性表达率更低； LKB1蛋白表达与体重指数无关(χ2=0.01，P=0.93)。

2.5 LKB1蛋白表达与合并2型糖尿病肝癌预后的关系

本组患者1、3、5年总体生存率为84.8%、72.6%、54.1%，LKB1蛋白阴性表达组与LKB1蛋白阳性表达组的中位生存时间分别是48个月和73个月，LKB1蛋白阴性表达组的生存时间显著低于LKB1蛋白阳性表达组，经Log-rank检验，组间比较差异有显著性(χ2=6.26，P=0.01，图1)。

表1 合并糖尿病肝癌组织中LKB1表达与临床病理因素的关系

表2 合并2型糖尿病肝癌组织中LKB1表达与糖尿病相关因素的关系(例，%)

2.6 合并2型糖尿病肝癌患者预后因素分析

单因素分析发现(表3)，重度肝硬化、肿瘤数量、复发后治疗、LKB1蛋白阳性表达是影响HCC患者术后生存率的重要预后因素。将单因素分析中影响患者总体生存率的重度肝硬化、肿瘤数量、复发后治疗、LKB1蛋白阳性表达等4个因素引入Cox回归模型做多因素分析发现，LKB1蛋白阳性表达、复发后治疗、肿瘤数量、重度肝硬化分别为影响肝癌患者术后生存率的独立预后因素，见表4。

图1 LKB1蛋白阴性表达组和LKB1蛋白阳性表达组总体生存时间比较

表3 影响肝癌患者术后OS危险因素的单因素分析

表4 影响肝癌患者术后OS的多因素分析

3 讨论

肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病标化率虽呈下降趋势，但仍处于高发状态[7]，受人口老龄化、代谢性疾病和不健康生活方式等因素的影响，合并2型糖尿病的肝癌患者正在增多，其死亡率时期效应仍呈上升趋势[8]，对合并2型糖尿病肝癌的研究正在提上日程。我们的前期研究发现[9]，合并2型糖尿病肝癌多见于有慢性乙型肝炎病史、糖尿病病程较长、超重或肥胖的男性肝硬化患者，且预后差于非糖尿病肝癌患者。糖代谢紊乱是合并2型糖尿病肝癌主要特点之一，而作为AMPK的上游激酶，在能量代谢和抑制肿瘤生长均有重要作用的LKB1，在血糖代谢紊乱和慢性乙型肝炎长期并存的肝癌组织中的表达情况及其对合并2型糖尿病肝癌患者预后的影响并未见报道。

研究发现，LKB1在胃癌[10]、结肠癌[11]、宫颈癌[12]和肺癌组织[13]中均表现为低表达，本研究也得到了相同的结果，合并2型糖尿病肝癌组织LKB1蛋白的阳性表达率明显低于正常肝组织(41.7%vs 100%)，组间比较有统计学差异。研究认为，抑癌基因LKB1突变与肿瘤发生密切相关，卵巢癌[14]、肝癌[15]中均发现了LKB1 基因突变，Lu等[16]认为LKB1基因突变使其蛋白激酶活性和细胞生长调控功能丧失，导致肿瘤发生，而LKB1蛋白的低表达作为LKB1基因突变后在蛋白水平上的表现，提示了LKB1蛋白的低表达可能与肝癌的发生存在关联。

本研究结果进一步发现，LKB1蛋白的表达与肝癌患者的肝硬化状态有关，肝硬化程度越重，LKB1蛋白阳性表达率越低，两者呈负相关性；另外，在空腹血糖高于正常水平和糖尿病病程超过5年的患者中，其LKB1蛋白阳性表达率要低于正常空腹血糖组和糖尿病病程小于5年的肝癌组，这提示患者的肝硬化程度和长期的血糖代谢紊乱状态对LKB1蛋白的表达存在一定的影响， LKB1的低表达可能降低了肝癌患者的预后，本研究结果也显示， LKBl蛋白阴性表达组的中位生存时间明显低于阳性表达组，经Log-rank检验，差异有显著性，Cox回归多因素分析发现：LKB1蛋白的阳性表达是肝癌预后的保护因素。

总之，本研究结果表明，在合并2型糖尿病肝癌组织，LKB1蛋白阳性表达率低，LKB1蛋白表达下调与肝硬化、空腹血糖和糖尿病病程相关，LKB1蛋白低表达是合并2型糖尿病肝癌患者的不良预后因素之一。