鲫鱼细菌性出血病致病菌的分离鉴定及药敏研究

祭仲石 韦 艳 厉成新 王中清 吴秀林

鲫鱼出血病，一般认为由嗜水气单胞菌引起，嗜水气单胞菌感染鲫鱼后，在鱼体质变差和水质恶化时，在鱼体内快速增殖，引起全身出血的症状。目前治疗出血病主要还是依靠投喂抗生素，但生产中多数养殖户根据以往经验使用抗生素，往往效果较差，疾病难以快速治愈，不仅造成养殖户的损失，还导致鲫鱼抗生素超标，影响食品安全。

江苏大丰某鲫鱼精养塘口2018年8月初开始发病，我们取样分离病原菌并鉴定，对分离的病原菌进行药敏试验，以指导养殖户科学用药，得到良好的治疗效果。

1 材料与方法

1.1 材料

发病鲫鱼2018年8月取自大丰鲫鱼精养塘口，200g左右，发病期间出现鲫鱼持续死亡，死亡鲫鱼体表充血，腹腔内有腹水，初步诊断为鲫鱼出血病。试验用药敏纸片采购自杭州微生物试剂有限公司；PCRMix、溴化乙锭（EB）、Marker 2000、细菌基因组提取试剂盒采购自北京艾德莱；用于扩增嗜水气单胞菌的引物由上海生工合成；微生物培养基为脑心浸液培养基（BHI），pH7.4±0.2，采购自OXOID。

1.2 致病菌的分离

在超净工作台中，用酒精灯灼烧后的接种环从患病鱼肝、肾、脑等组织处取样，涂布在培养基平皿上，30℃培养24小时。挑选优势菌落接种于斜面培养基，30℃培养24 小时，4℃冰箱保存备用。

1.3 回归攻毒实验

将分离到的致病菌接种到BHI液体培养基中，30℃培养24小时，用生理盐水将菌液稀释至108cfu/mL备用。取健康鲫鱼60尾，随机分为两组，每组30尾。试验组每尾注射0.2mL菌液，对照组每尾注射0.2mL生理盐水，饲养10天，每天捞出死亡鲫鱼，记录死亡数量，并对死亡鱼进行细菌分离。

1.4 致病菌鉴定

按照细菌基因组提取试剂盒说明书，提取从患病鲫鱼和攻毒死亡鲫鱼上分离到的致病菌DNA，使用嗜水气单胞菌16S rDNA引物扩增致病菌DNA，正向引物F:GCGGGTACGACGCACCTTGC、逆向引物R:CAGCGTCCAATACCTGGTGTTA，目的片段长度为1091bp，扩增条件为: 94 ℃预变性4 min， 94 ℃变性50 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s， 30 个循环，最后72 ℃延伸10 min。PCR扩增后，用添加EB的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳电压120V、电泳15分钟。电泳后使用紫外分析仪观察结果。

1.5 药敏试验

采用纸片琼脂扩散法（K-B法），在超净工作台中，将分离到的致病菌用生理盐水制备成浓度约107～108cfu/mL细菌悬浊液，取100μL均匀涂布于BHI平板上，等待15分钟左右，使细菌在培养基上定植，然后将不同的药敏纸片均匀的贴在BHI平板上，30℃培养24小时后，观察结果，量取抑菌圈直径，确定致病菌对各药物的敏感性。

2 结果

2.1 鲫鱼出血病的发病情况

发病塘口位于江苏大丰，塘口面积90亩，东西朝向，鱼塘四周水泥护坡，水深2～2.5m，进排水配套设施完善。2018年8月4日开始，开始每天有十几尾死鱼，三天后突然增加到一百多尾，死鱼呈典型的出血病状况，患病鱼腹部，鳍条基部等多处充血，鱼眼球突出，解剖后腹腔内有红色腹水，肠道充血，肠内无食。

2.2 回归攻毒结果

将分离到的致病菌编号为HFJY-1，注射到鲫鱼体内后，第2天开始出现死鱼，第5天鲫鱼全部死亡，死亡率100%，对照组养殖10天未见死亡，攻毒情况见表1。死亡鲫鱼表现出与患病鲫鱼相同的症状，体表、鳍条基部不同程度出血，解剖可见肝脏肿胀充血，有大量腹水。从攻毒死亡鲫鱼肝脏分离的致病菌，与HFJY-1的菌落形态一致，编号为HFGD-1。

表1 攻毒感染实验

2.3 致病菌的鉴定

从鲫鱼的肾和肝上分离到致病菌，其在BHI培养基上生长较快，24小时后可见明显菌落，菌落呈圆形，边缘光滑，淡白色。患病鲫鱼和攻毒鲫鱼致病菌的PCR电泳图谱中可以看出，HFJY-1和HFGD-1使用嗜水气单胞菌引物做PCR，在1000bp位置左右出现明显亮带，阴性对照未出现条带，说明这两株致病菌是嗜水气单胞菌。

2.4 致病菌的药敏分析

使用水产养殖中常用的氟苯尼考、恩诺沙星、强力霉素、硫酸新霉素、土霉素、红霉素、复方新诺明和复方磺胺嘧啶等8种抗生素对分离到的两株致病菌进行药敏实验，药敏实验结果见表2，结果表明，分离的嗜水气单胞菌对恩诺沙星、氟苯尼考敏感，红霉素、强力霉素、硫酸新霉素和复方磺胺嘧啶中度敏感，对复方新诺明和氨苄青霉素耐药。

3 讨论

随着塘租、饲料、渔药和人工等成本的逐年增加，养殖户放养密度越来越高，加上缺少科学的疾病防控理念，细菌性疾病暴发越来越频繁。我国水产养殖从业门槛低，多数的养殖户缺乏科学的用药理念，甚至一些渔药厂家的业务员都不是水产养殖专业，简单培训几天就指导养殖户，往往为了利益胡乱指导。甚至还有养殖户使用抗生素进行细菌性疾病的预防，导致各类致病菌产生耐药性。

鲫鱼出血病是危害鲫鱼的主要病害之一，随着多年的抗生素使用，嗜水气单胞菌已对多种抗生素产生耐药性。目前，水产上治疗细菌性疾病，主要还是通过投喂抗生素外加泼洒，但如何选择正确的抗生素成为治疗成败的关键因素。本文结果表明，嗜水气单胞菌已对多种抗生素产生不同程度的耐药性，导致我国水产品抗生素频频超标，影响我国水产养殖的健康发展，这是多年来抗生素的乱用滥用造成的。

表2 各抗生素药敏结果

水产从业者在治疗细菌性疾病时，应当科学地选择抗生素，通过药敏实验，选择最优的治疗药物，避免盲目用药导致疾病无法有效控制。本文发病塘口在药敏实验后，外用泼洒复合碘两次，每次间隔一天，并选择恩诺沙星作为治疗药物，拌服抗生素后，死亡量大大降低，从每天死亡两百多条到后来几条，5天后没有死鱼，没有死鱼后继续投喂药饵两天巩固治疗。在发生细菌性疾病时，不能盲目地使用抗生素，要尊重科学，用科学的理念指导养殖用药，真正做到科学用药，减缓致病菌耐药性的产生。