狐沙门氏菌的耐药性分析

孙娜，陈强，程悦宁，王改丽，杨勇，王超，马红霞，程世鹏※

（1.中国农业科学院特产研究所特种经济动物分子生物学重点实验室，长春 130112；2.长春大学，长春 130022；3.吉林大学，长春 130062；4.吉林农业大学，长春 130118）

沙门氏菌病主要是由沙门氏菌（Salmonella）引起的。沙门氏菌是公共卫生学上重要的肠道致病菌，是重要的人、畜共患病原菌之一，主要通过感染的食物直接或间接引起人类感染。沙门氏菌在自然界分布较广，且血清型种类繁多，感染人和动物的常见血清型有鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium）、肠炎沙门氏菌（S.enteritidis）、纽波特沙门氏菌（S.newport）、海德堡沙门氏菌（S.heidelberg）和猪霍乱沙门氏菌（S.choleraesuis），不同国家和地区的优势血清型不同，不同血清型的沙门氏菌的致病性也不同[1]。由于沙门氏菌血清型较多的特点，目前治疗和预防沙门氏菌感染的主要方法是使用抗生素[2-3]。但由于近几年抗生素长期、大量、不恰当地使用，致使其耐药性逐渐增强，尤其是多重耐药现象比较严重，且耐药数据呈现逐年递增的趋势，严重影响了临床治疗效果，对人类健康造成了一定的威胁[4-6]。沙门氏菌耐药性的严重性不仅体现于人源和家畜、家禽等动物源的菌株，毛皮动物源沙门氏菌的耐药性也越来越严重。本研究从2017年吉林省某狐养殖场送检的2只患有沙门氏菌病的病死狐中分离得到2株沙门氏菌，并对分离菌株药物敏感性及耐药基因进行检测，为指导临床合理用药和进一步研究耐药性的传递机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 标准菌株大肠埃希菌ATCC25922；2株沙门氏菌分离于患有沙门氏菌病的病死狐的肝脏和脾脏等样品，通过生化鉴定和PCR方法鉴定为沙门氏菌，由中国农业科学院特产研究所特种动物病原与免疫实验室保存。

1.1.2 试剂 LB肉汤（青岛海博生物技术有限公司）；SS琼脂（Oxoid公司）；生化鉴定试剂管和常用新药敏纸片（杭州滨和微生物试剂有限公司）；Premix Tap Version 2.0、DL2 000 DNA Marke（r50 ng/L）〔（宝生物工程（大连）有限公司〕；细菌基因组DNA提取试剂盒（北京百泰克公司）。

1.2 方法

1.2.1 药敏试验 采用K-B药敏法，取临床上已经分离的菌株，经37℃孵育18～24 h后的细菌培养物，用0.85%无菌生理盐水制成0.5 mcF，参照美国临床和实验室标准化协会（CLSI）推荐的标准进行解释。质控菌选用大肠埃希菌ATCC 25922。

1.2.2 耐药基因检测 按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取菌株的基因组DNA作为PCR模板，根据已有文献报道设计合成引物，扩增氨基糖苷类、-内酰胺类、四环素类、氯霉素类等15种耐药基因[7]。PCR反应体系（25L）：2 PCRpremix 12.5L，上、下游引物（10mol/mL）各 0.5L，模板DNA 1.0L，灭菌双蒸水加至25L。将PCR阳性产物送往吉林省库美生物科技有限公司进行测序，确认目的基因。

2 结果与分析

2.1 药物敏感性分析

选用临床常用的14种抗菌药物对2株沙门氏菌进行药物敏感性试验，参考CLSI动物源细菌药物敏感性试验标准判断结果。试验结果见表1。

表1 沙门氏菌药物敏感性试验结果Table 1 Drug sensitivity result of Salmonella

2.2 耐药基因检测结果

2株分离菌株均携带以下7种耐药基因：-内酰胺类耐药基因（blaTEM-1）、氨基糖苷类耐药基因（aac(3')-Ⅱc）、aac(3')-IV、aadA1、四环素类耐药基因 tet（A）、tet（C）及氯霉素类耐药基因（cat2）。电泳结果见图1～7。

图1 aac(3')-Ⅱc的PCR电泳结果Fig.1 PCRamplification electrophoresis result of aac(3')-Ⅱc

图2 aac(3')-Ⅳ的PCR电泳结果Fig.2 PCR amplification electrophoresis result of aac(3')-Ⅳ

图3 aadA1的PCR电泳结果Fig.3 PCR amplification electrophoresis result of aadA1

图4 tet（A）的PCR电泳结果Fig.4 PCR amplification electrophoresis result of tet(A)

图5 tet（C）的PCR电泳结果Fig.5 PCR amplification electrophoresis result of tet(C)

图6 cat2的PCR电泳结果Fig.6 PCR amplification electrophoresis result of cat2

图7 blaTEM-1的PCR电泳结果Fig.7 PCR amplification electrophoresis result of blaTEM-1

3 结论与讨论

沙门氏菌是非常重要的人、畜共患病原菌，该菌的流行及其引发的疾病已经严重影响公共卫生问题。在自然条件下，毛皮动物中狐狸、海狸鼠等动物容易患沙门氏菌病，而水貂、紫貂等抵抗力较强。该病的主要传染来源是被沙门氏菌污染的饲料，另外，饲养密度过大、饲料变质以及卫生防疫不好等因素也是该病发生的诱因。目前，沙门氏菌病已严重影响毛皮动物养殖业的发展，必须引起养殖人员的高度重视。近年来，关于人源和动物源沙门氏菌耐药性的报道很多，但是有关狐源沙门氏菌耐药性的报道很少[8-9]。王海洲[10]报道，2011年7月，在临沂市沂南县苏村某狐狸养殖场暴发沙门氏菌病，发病率7%，病死率50%，且多呈急性死亡；药敏试验结果表明，狐沙门氏菌对头孢喹肟、粘杆菌素、丁胺卡那、氧氟沙星敏感，对氟苯尼考、硫氰酸红霉素、强力霉素、壮观霉素部分中敏，对庆大霉素、氟哌酸和青霉素不敏感，对其他药物都呈现一定程度的耐药性。梁萍等[11]报道，自2010年3月初开始，山东省新泰市某狐场暴发沙门氏菌病，母狐流产率达15%，严重影响了该养殖场的效益。郭凤铭等[12]报道，2011年，某狐狸养殖场饲养的雪狐有30%感染沙门氏菌，发病率非常高。由此可知，在狐狸养殖场中沙门氏菌病的发病率极高，已严重影响了养狐业的发展。

本试验主要对从患有沙门氏菌病的病死狐中分离得到的2株沙门氏菌进行药物敏感性和耐药基因检测。结果表明，2株沙门氏菌对头孢类药物、左氧氟沙星和多粘菌素较敏感，对氨基糖苷类药物、四环素、氨苄西林、诺氟沙星、环丙沙星和氯霉素全部表现为耐药。2株沙门氏菌均检测出aac(3')-Ⅱc、aac(3')-IV、aadA1、tet(A)、tet(C)、cat2、blaTEM-17 种耐药基因。由此可见，分离得到的沙门氏菌主要表现为多重耐药现象，且携带的耐药基因主要呈现为多样性，进一步加强了菌株的耐药性以及耐药性的传播。2株菌株的耐药性和耐药基因携带情况均相同，说明同一养殖场在同种用药的情况下细菌产生相同的耐药性。本研究中菌株的药物敏感性试验结果与其他研究有不同之处，主要原因在于不同年份和地区所使用的抗菌药物种类和剂量不同，致使产生的耐药性也有所差别。另外，如果狐食用被大量投喂抗生素的肉鸭的鸭架、鸭肝、肉鸡的鸡架或是其他来源的食物，也会加快细菌耐药性的产生。本研究中的菌株对诺氟沙星和环丙沙星表现为耐药，但是耐药基因检测却未发现相应的耐药基因，由此推测，耐药菌株可能存在其他的耐药基因或是其他耐药机制。因此，在治疗细菌性疾病时，应严格按照分离菌株药物敏感性试验结果合理使用抗生素类药物，避免细菌耐药性的产生，以达到良好的治疗效果。