星点设计优化野黄芩素制备工艺

郝秀华，孙悦，王蕾，杨锦竹

（吉林大学药学院，长春 130021）

野黄芩素也称灯盏乙素苷元，为灯盏乙素脱去1个葡萄糖后的多羟基黄酮类化合物。近年来研究表明，其具有较灯盏乙素更为广泛的药理作用，如脑缺血保护作用[1]、抗炎抗癌作用[2-3]及抗帕金森症[4-5]等具有良好的药用潜质。但由于化学性质不稳定及体内代谢复杂[6-7]，该药物在制备方法及药动学等相关领域尚有较大研究空间。目前，关于野黄芩素制备主要有全合成法[8-9]、水解法[10]（也称半合成法）及生物转化法[11]等。水解法较其他方法具有反应物易获得、产物较为纯净和制备方法简单的优点。本试验在廖霞俐[12]及周荣光等[13]建立的水解法基础上，利用CCD（Central composite design，CCD）优化水解反应条件，旨在得到更为高效的野黄芩素制备方法。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

野黄芩素对照品（≥98%，上海荣创生物技术有限公司）；灯盏乙素（95.5%，云南玉溪万方天然药物有限公司）；磷酸二氢钾（AR，20100906，北京化工厂）；冰醋酸（AR，20061019，北京化工厂）；甲醇（色谱纯，20160805156，山东禹王实业有限公司化工分公司）；乙腈（色谱纯，国营浙江黄岩化学实验厂）；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

玻璃点样玻璃管（华西医科大学仪器厂）；硅胶G薄层板（20140806，青岛海洋化工厂分厂）；SHIMADZU高效液相色谱系统（SPD-20A型紫外检测器，LC-20AT泵，日本岛津公司）；N2000色谱工作站（浙江大学）。

1.3 野黄芩素制备

称取适量灯盏乙素于三颈烧瓶中，加入95%乙醇，在氮气保护下加入浓硫酸，75℃水浴加热至反应结束，以薄层色谱（TLC）监测反应进程[14-15]。反应结束后，立即向三颈瓶中倾入大量蒸馏水，体积为反应介质3～5倍量，使沉淀析出。将沉淀快速滤过并以蒸馏水洗涤至中性，真空烘干即得野黄芩素粗品，称重，冷藏待用[12-13]。

1.4 单因素试验

试验过程中影响产物纯度、收率及反应时间的因素主要为灯盏乙素与95%乙醇固液比、硫酸加入量、反应温度，故分设不同水平，以完全反应所用时间及野黄芩素粗品收率为评价指标，分别进行单因素考察试验。

1.5 CCD制备工艺优化

CCD是一种通过绘制试验结果的二维或三维效应面图以直接选取最优工艺条件的高效直观、多因素多水平试验设计的方法，在药物制剂处方优选或化学合成工艺优选方面得到了广泛应用[16-18]。根据单因素试验结果，结合CCD进行野黄芩素半合成工艺条件优选。

由于选取的评价指标反应完全所需要的时间取值越小越好，而粗品收率取值越大越好，因此采用归一化法来综合2个评价指标[19]，即对于取值越大越好的因素，即试验中粗品收率（Y1），归一值d1=dmax=（yi-ymin）/（ymax-ymin）；对于取值越小越好的因素，即试验中完全反应所需时间（Y2），归一值 d2=dmin=（ymax-yi）/（ymax-ymin）；总评归一值，OD（Overall desirability）=（d1d2）1/2，则OD值越大，表示反应条件越有利于野黄芩素制备。

2 结果与分析

2.1 单因素考察

2.1.1 灯盏乙素与95%乙醇固液比 反应温度75℃，每0.15 g灯盏乙素加入硫酸量2.5 mL，氮气保护。分设固液比梯度，考察灯盏乙素与95%乙醇固液比对制备工艺的影响，结果见图1。由图1可知，灯盏乙素与95%乙醇固液比对反应影响加大，OD值有明显波动。故以灯盏乙素与95%乙醇固液比（X1）为主要考察因素，利用CCD法对合成工艺条件进行优化[20]。

图1 固液比对制备工艺的影响Fig.1 Effects of different solid-liquid ratios on preparation process

2.1.2 反应温度 灯盏乙素与95%乙醇固液比为15 g/L（0.15 g灯盏乙素加入10 mL 95%乙醇），且每0.15 g灯盏乙素加入硫酸量2.5mL，氮气保护。分设温度梯度，考察反应温度对制备工艺的影响，结果见图2。由图2可知，反应温度对反应影响加大，OD值有明显波动。故以反应温度（X2）为主要考察因素，利用CCD法对合成工艺条件进行优化[20]。

图2 温度对制备工艺的影响Fig.2 Effects of different temperatures on preparation process

2.1.3 硫酸加入量 灯盏乙素与 95%乙醇固液比为15g/L，反应温度75℃，氮气保护。灯盏乙素0.15g中分别加入不同量浓硫酸，考察硫酸加入量对制备工艺的影响，结果见图3。由图3可知，反应中加入硫酸的量对试验结果影响相对较小，综合考虑制备成本，选择硫酸加入量为3 mL。

图3 硫酸加入量对制备工艺的影响Fig.3 Effectsof different amounts of sulfuric acid on preparation process

2.2 CCD制备工艺

因素水平试验设计及结果见表1、2。以SAS软件处理表2，以OD值为指标，对X1、X2进行多元线性回归，多元线性回归方程：Y=1.647 6+0.005 6 X1+0.027 7 X2，R=0.576 4，P=0.132 8，不具有统计学意义，因此多元线性回归方程未通过检测，不能真实地反映各因素对指标的影响。对试验结果进行二项式分布拟合得Y=5.9390+0.1259X1+0.1226X20.0049X120.0007 X22+0.0004X1X2。R=0.8763，P=0.0347。相较于多元线性回归方程，选用二项式拟合模型作为该试验的拟合模型。经 Statistica6.0绘制等高线及效应面图见图4、5，方差分析结果见表3。

表1 CCD因素与水平Table 1 Levels and factorsof CCD

表2 CCD试验结果Table 2 Results of CCD

图4 等高线图Fig.4 The contour plot

图5 效应面图Fig.5 The 3D surface plot

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

由图4、5可知，效应面为不规则曲面，故各因素与总归一值间存在非线性关系。OD值越大试验结果效果越好即曲面顶端为最优值[21]，最佳工艺条件为固液比15～17g/L、反应温度80～85℃。在较佳范围内任取3个点进行验证，验证试验结果见表4。

表4 验证试验结果Table 4 Results of verification experiment

由表4可知，二项式模型的R为0.8763，Prob＞F值0.03，回归方程拟合良好，模型建立较显著（P＜0.05），此模型可以很好地对灯盏乙素水解制备野黄芩素的工艺条件进行预测。由图4、5可以观察到该试验结果的最佳区域，在该区域内选取对应的工艺条件即可获得较理想的试验结果，即当固液比15～17g/L、反应温度80～85℃时，可通过较短时间得到较理想的产物收率。验证试验的OD值偏差均较小，表明拟合方程的预测性良好，可用于灯盏乙素水解制备野黄芩素的工艺优化。

2.3 产物纯化

将所得干燥野黄芩素粗品以甲醇溶解后，加入少量冰醋酸，通入氮气，排出容器中空气，并定时进行氮气排气保护，将装置置于避光、干燥、阴凉处重结晶[22-24]。结晶产物滤器滤过并以氮气吹干。取少量纯化野黄芩素进行TLC检测，杂质较多则依上述操作过程再次重结晶，杂质较少则进行高效液相色谱（HPLC）含量测定[25-27]，结果见图6。利用野黄芩素标准品以单点对照法对所得纯化样品进行测定，结果，重结晶野黄芩素样品含量可达95%以上。

图6 TLC检测结果Fig.6 TLCdetection results

3 结论与讨论

反应条件筛选将总评“归一值”概念引入到CCD中，可同时选用多个评价指标，优化方法较为简便、严谨且具有直观性。作为一种多羟基的黄酮化合物，野黄芩素化学性质极其不稳定，易被氧化。试验过程中当温度大于80℃时，反应后期可明显观察到有棕绿色物质生成，TLC结果显示，杂质含量增多，考虑为生成的野黄芩素被氧化后的反应副产物。因此，该试验最终确定最优工艺条件为固液比15g/L、反应温度80℃。反应所得产品经重结晶纯化后纯度可达95%及以上。

本试验所采用的野黄芩素制备方法较全合成法及微生物法步骤简单、反应时间短，可短时间内得到质量较好的野黄芩素粗品。低温重结晶可使产品纯度大幅度提高，但完全析出过程较为漫长，低溶解性导致溶剂消耗较大且反复重结晶致产品部分损失。