水貂DAZL基因的DNA池测序分析

刘琳玲，丛波，刘宗岳，王桂武，宋兴超，杨福合

（中国农业科学院特产研究所特种经济动物分子生物学国家重点实验室，长春 130112）

DAZ（Deleted in Azoospermia）基因家族在精子形成过程中起着非常重要的作用[1]。DAZ基因家族包括DAZ基因、DAZL基因和BOULE基因3个成员[2]。DAZ家族的共同特征是编码一个保守的RNA识别基序（RNA recognition motif RRM）和不同数量的24个氨基酸DAZ重复基序[3]。在人、果蝇、老鼠、蝾螈、斑马鱼和青鳉等研究中表明，DAZL基因对减数分裂和生殖细胞发育中起到重要作用[4]。DAZL基因影响着PGC细胞的生成和卵母细胞的配子形成。人的DAZL基因多态性与精子生成或者精子数量下降具有相关性。Reynolds[5]发现，DAZL基因缺失会引起小鼠Mvh蛋白表达量下降。

目前，DAZL基因在水貂上的研究还没有报道。本研究选取短毛黑、银兰、红眼白3个品种的公水貂为研究对象，构建品种DNA池，采用PCR技术扩增后直接测序来分析DAZL基因。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物为中国农业科学院特产研究所毛皮动物实验基地的短毛黑、银兰、红眼白公水貂各20只。水貂打处死针以后，真空采血管心脏采血5 mL，20℃保存备用。

用血液基因组提取试剂盒提取基因组DNA，提取基因组放在 80℃保存。用紫外分光光度计测量每个DNA样品浓度，再稀释为100ng/L。每个品种20个样品，各取5L，分别构建短毛黑、银兰、红眼白品种DNA池。

1.2 引物设计

在Genebank中找到猪、牛、羊等DAZL基因，利用DNAman软件找出保守区域，采用引物分析软件Primer Premier5.0分析设计特异性 DAZL基因部分CDS区引物。引物为：

D1:5′-CAAACCTCCTGGAAGAAT-3′

D2:5′-CTTGTCTAAACCCAGTAAAA-3′

引物由吉林省库美生物科技有限公司合成。

1.3 PCR反应

PCR 反应条件：94℃5 min；94℃30 s，52℃30 s，72℃30s，共 30 个循环；72℃5 min；4℃保存。取 5L PCR产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 扩增产物测序

经PCR扩增，琼脂糖电泳检测合格，送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.5 数据分析

测序结果进行人工校正后，利用MEG5.0软件和DNAMAN软件，BLAST分析确定SNPs和同源性分析。序列比对后，用MEGA6软件构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 3个品种水貂的PCR扩增结果

利用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，扩增片段大小与预测大小一致，特异性好，可以进行直接测序分析，结果见图1。

图1 DAZL基因部分CDS区PCR扩增结果Fig.1 Electrophoresisof theproductsof sequencein partsof CDS of DAZL gene in mink

2.2 DAZL基因部分CDS区序列分析和同源性分析

以短毛黑、银兰、红眼白3个品种水貂构建DNA池，通过PCR扩增，扩增产物测序结果如图2，BLAST未发现SNPs。将所测序列与GenBank中的雪貂、猪、犀牛、骆驼、牛、河豚进行同源性分析，结果见表1。水貂与雪貂同源性很高（94.2%），与猪、犀牛、骆驼、江豚同源性较高（80.8%～81.8%），与牛的同源性较低（77.4%）。

2.3 构建系统进化树

在Genebank中下载不同物种的序列，进行序列对比分析，并用MEGA6软件分析进化关系，构建不同物种的系统进化树，结果见图3。系统进化树显示，水貂与雪貂属同一分支。

图2 DAZL基因部分CDS区测序结果Fig.2 Sequencing result of sequence in partsof CDSof DAZL gene in mink.

图3 系统进化树Fig.3 Phylogenic tree

表1 同源性分析Table 1 Nucleotide homology analysis （%）

3 讨论

DNA池是将具有一共同特征群体的部分个体DNA提取以后，经过定量稀释成一定浓度，按比例或者等量混合构成一个池[6]。DNA池技术用来快速研究品种间的遗传差异，快速、简便、效率高、成本低，缩短了研究周期。初芹等[7]利用DNA池测序法，根据测序峰图中不同碱基信号峰高的比值确定了牛的92个SNP为高信息量标记。宋桃伟等[8]利用DNA池技术研究猪GH基因启动子序列的多态性。杨永强等[9]利用DNA池快速筛查牛SOCS2、SOCS3和CIS基因SNPs。陈志等[10]利用DNA池研究了3个品种山羊的CXCL10基因多态性，筛查到了2个与繁殖性能相关的单核苷酸多态性。乔冬雨等[10]利用DNA池技术分析8个品种牛的大理石花纹评分相关基因变异的微卫星分析。刘文博等[11]利用混合样本池检测了鸡显性白羽基因PMEL17的突变位点。赵冰茹等[12]基于DNA池重测序技术，研究分析了细毛羊 LAMB1基因的SNPs。李敬瑞等[13]对猪DAZ基因的DNA池进行了测序分析。

短毛黑、银兰、眼白3个品种水貂的毛绒品质和体型特征都有差异。3个品种的公水貂都来源于健康的纯种貂群。从测序和分析结果可以看出，不同品种水貂间DAZL核苷酸序列完全一致；同源性分析表明，水貂与雪貂同源性很高（94.2%），与猪、犀牛、骆驼、江豚同源性较高（80.8%～81.8%），与牛的同源性较低（77.4%）。系统进化树显示，水貂与雪貂属同一分支。