杨芽黄素对前列腺癌细胞凋亡的影响及其机制*

王 瑜, 柯瑞君, 蒋盼若, 应佳豪, 楼恩哲, 陈佳玉

(绍兴文理学院医学院， 浙江 绍兴 312000)

前列腺癌是危及男性健康的常见疾病之一，在男性恶性肿瘤中的发病率排名呈持续快速增长的趋势。有研究显示，美国2014年前列腺癌发病率约为100/10万，且预计在2018年前列腺癌有新发病例164 690人，死亡病例为29 430人，将成为最常见的男性恶性肿瘤[1]。据2018年中国国家癌症中心数据显示，前列腺癌以9.8/10万的发病率取代膀胱癌跃居我国男性泌尿生殖系统恶性肿瘤的首位。目前，现有的化疗药物虽然在一定程度上能抑制前列腺癌细胞的增殖和转移，但因副作用太大和易产生肿瘤耐药性等原因而使治疗效果并不理想。因此，高效益、低毒性抗癌新药的研制已成为前列腺癌治疗的必然趋势。

杨芽黄素(tectochrysin)为黄酮类化合物，它广泛存在于水果和蔬菜中，具有抗炎、抗氧化、抗心脑血管疾病等作用[2-4]。已有研究表明，杨芽黄素除了可通过使STAT3失活而抑制非小细胞型肺癌细胞生长的作用外[5]，尚可通过抑制NF-κB通路、增强死亡受体表达等途径而具有抗结肠癌的作用[6]。但目前尚无有关该药是否具有抗前列腺癌的作用及其分子机制的研究。

细胞凋亡是一种细胞有序主动的死亡，在正常人体内，细胞凋亡和抗凋亡一直处于一种动态平衡状态，目前认为肿瘤的发生与这种平衡状态被打破密切相关。所以诱导肿瘤细胞发生凋亡一直是肿瘤治疗的重要治疗策略之一，同时靶向凋亡信号通路的药物研发也成为肿瘤治疗研究的热点[7,8]。因此本研究将不同剂量的杨芽黄素作用于前列腺癌细胞22Rv.1，观察其作用效果，以期发现治疗前列腺癌的新药并揭示其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

正常前列腺细胞株RWPE-1和前列腺癌细胞株22Rv.1为本实验室所保存。洁净级BALB/c小鼠购自于浙江省实验动物中心。杨芽黄素来源于武汉天植生物技术有限公司。Cell Counting Kit-8(CCK-8)购自美国MedChem Express公司。胎牛血清、RPMI-1640培养液、PBS和胰蛋白酶均由美国Gibco公司生产。AnnexinV-FITC/PI双染试剂盒和脱脂奶粉源自美国BD公司。Hoechst 33342、BCA蛋白浓度测定试剂盒和RIPA裂解液(强)由上海Beyotime公司提供。一抗和酶标二抗购自于武汉BOSTER Biotech公司。PCR各引物由上海Sangon Biotech公司合成。LDH试剂盒购自上海Roche Applied Science公司。TRIzol、SuperScript®III First-Strand Synthesis System于美国Invitrogen公司购买。ECL化学发光液为美国Sigma公司产品。

1.2 细胞培养

取对数期的RWPE-1和22Rv.1细胞，将细胞用含10 %胎牛血清的RPMI 1640完全培养液稀释至5 × 104cells/ml。

1.3 细胞增殖实验

取完全培养液稀释后的RWPE-1和22Rv.1细胞于96孔板中以每孔100 μl的接种量接种，在37℃ 5% CO2的细胞培养箱中培养约3 h。待细胞完全贴壁后，加入杨芽黄素，使其终浓度分别为0、2.5、5、10和20 μg/ml，设3复孔，将细胞在37℃ 5% CO2的细胞培养箱中分别培养0 h、24 h、48 h和72 h。待药物作用结束后，于每孔加入10 μl CCK8溶液，震荡混匀后于细胞孵箱中继续孵育3 h，然后用酶标仪于490 nm波长下检测吸光度(OD值)。

1.4 流式细胞仪检测RWPE-1以及22Rv.1细胞凋亡和细胞周期

将完全培养液处理后的RWPE-1和22Rv.1细胞以2 ml/well的剂量接种到6孔板中，并将细胞放置于37℃ 5% CO2条件的细胞培养箱下进行培养。待细胞长至80%融合时，弃培养液，设三复孔，分别加入含有0、2.5、5、10和20 μg/ml浓度杨芽黄素的RPMI 1640完全培养液后，将细胞继续置于细胞培养箱中培养24 h，将细胞用细胞凋亡(FITC、PE)和细胞周期(PI)染色试剂盒染色后，最后通过流式细胞仪检测细胞凋亡和死亡的百分比以及细胞周期分布的改变，试剂用量和染色方法按试剂说明书进行。

1.5 Hoechst 33342染色法检测RWPE-1和22Rv.1细胞核型变化

将完全培养液培养稀释好的RWPE-1和22Rv.1细胞以2 ml/well的剂量分别接种于6孔培养板，并将细胞放置于37℃ 5% CO2条件的细胞培养箱下进行培养。待细胞长至80%融合时，弃培养液，设三复孔，分别加入含有0、10和20 μg/ml浓度杨芽黄素的RPMI 1640完全培养液后，将细胞继续置于细胞培养箱中，培养24 h后取出细胞，将细胞进行hoechst 33342染色后(试剂用量和染色方法按说明书进行)，最后在荧光倒置显微镜下观察细胞核型变化。

1.6 LDH释放实验检测杨芽黄素对22Rv.1细胞的细胞毒作用

分别用0、2.5、5、10和20 μg/ml浓度的杨芽黄素于37℃ 5% CO2条件下作用细胞融合度为80 %的22Rv.1细胞，待作用24 h后，收集细胞和培养上清，用乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒测定LDH水平，试剂用量和实验方法按试剂盒的说明书进行。并通过计算LDH释放率(%)=培养液中LDH含量 /(培养液中LDH含量+细胞裂解液中LDH含量)×100%，以分析杨芽黄素对22Rv.1细胞的细胞毒作用。

1.7 QPCR实验检测22Rv.1细胞内基因的转录水平

分别用含有0 μg/ml和10 μg/ml杨芽黄素的完全培养液培养22Rv.1细胞24 h，用TRIzol提取细胞总RNA，经Nano Drop2000定量后用SuperScript®III First-Strand Synthesis System逆转录成cDNA(试剂用量和操作均按说明书进行)。以β-actin为内参，qPCR法检测细胞内trail、p53、dr4、dr5、foxo3、caspase-3、caspase-8、caspase-9、bid、bax、akt、pi3k和bcl-2基因的转录水平，qPCR反应条件为95℃ 5 min，95℃ 15 s，60℃ 35 s，共40个循环。记录各基因mRNA的CT值，通过2-△△CT法进行数据分析，探讨杨芽黄素作用后22Rv.1细胞内基因转录水平的改变。

1.8 Western blot实验检测22Rv.1细胞内蛋白的水平

分别取经含有0、5、10和 20 μg/ml杨芽黄素的完全培养液作用24 h后的22Rv.1细胞，用PBS洗3次，1 000 r/min、5 min进行离心，离心后完全弃上清，加入适量细胞裂解液，提取蛋白，经蛋白定量试剂盒定量后，选用β-actin为内参进行Western blot，分析细胞内蛋白TRAIL、P53、DR4、DR5、FOXO3、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、BID、BAX、AKT、PI3K和BCL-2的水平，蛋白上样量为40 μg，各一抗和酶标抗体稀释倍数取试剂说明书建议用量范围的均值。ECL显色后，利用Image Quant LAS 4000 mini超灵敏化学发光成像仪进行图像采集，通过photo shop软件测定各蛋白条带的灰度，分析杨芽黄素作用后22Rv.1细胞内蛋白水平和活性的改变。

1.9 抑瘤实验

取4周龄雄性BALB/c小鼠，随机分为5组，每组20只。在无菌条件下饲养一周以适应环境。取对数生长期的前列腺癌细胞22Rv.1，以1 000 r/min离心5 min，去上清，再用PBS清洗2次(1 000 r/min离心5 min)，取细胞并用生理盐水稀释成5 × 107cells/ml，于每只小鼠的腹股沟处注射0.1 ml细胞悬液。2 d后，各组分别皮下注射0、1、5、25、125 mg/kg剂量的待测药，每隔1 d注射一次，首次注射药剂的20 d后每组杀10只鼠，取瘤组织称重。记录每组剩下的10只小鼠的生存时间，分析该药的抑瘤作用。

1.10 统计学处理

2 结果

2.1 杨芽黄素对RWPE-1和22Rv.1细胞增殖活性的影响

杨芽黄素(0、2.5、5、10和20 μg/ml)分别作用前列腺癌细胞22Rv.1和前列腺正常细胞RWPE-1 0 h、24 h、48 h和72 h。结果如表1所示，2.5～10 μg/ml杨芽黄素对22Rv.1细胞的增长较正常前列腺细胞RWPE-1有显著的抑制作用(P<0.01，n= 3)，并且作用效果随着用药剂量和用药时间的增加而增强，但当用药剂量达到20 μg/ml时，杨芽黄素在明显抑制22Rv.1细胞增殖的同时也明显抑制正常前列腺细胞RWPE-1的增殖，因此，在2.5～10 μg/ml剂量范围内，杨芽黄素可安全有效的用于前列腺癌的治疗。

2.2 杨芽黄素对RWPE-1和22Rv.1细胞的细胞凋亡和死亡的影响

分别用0、2.5、5、10和20 μg/ml浓度的杨芽黄素作用RWPE-1和22Rv.1细胞24 h。流式细胞仪检测结果如表2所示，杨芽黄素诱导了前列腺癌细胞22Rv.1凋亡和死亡，且作用效果随着用药剂量的增加而增加。同时实验结果也证实，杨芽黄素用药剂量在2.5～10 μg/ml范围内，对正常前列腺细胞死亡和凋亡率的影响远小于对前列腺癌细胞22Rv.1的影响。

Tab. 1 The effects of tectochrysin on the proliferation activity of RWPE-1 and 22Rv.1 cells n=3)

*P<0.01vs0 μg/ml group

Tab. 2 The effects of tectochrysin on the apoptosis and death percentage of RWPE-1 and 22Rv.1 cells n=3)

*P<0.01vs0 μg/ml group

2.3 杨芽黄素对22Rv.1细胞的细胞周期的影响

分别用0 μg/ml和10 μg/ml浓度的杨芽黄素作用于22Rv.1细胞24 h，PI染色后通过流式细胞仪分析各期细胞的百分比，结果如图1所示，22Rv.1细胞经10 μg/ml杨芽黄素作用后，处于Sub-G1细胞的比例显著增加(由0.24 %±0.04%增加到 29.44 %±0.07%，P<0.01，n=3)，G2期细胞的比例显著减小(由20.21 %±0.08%减少至3.86 %±0.05%，P<0.01，n=3)。提示杨芽黄素在促进22Rv.1细胞凋亡的同时可将细胞阻滞于G2期之前。

Fig.1The cell cycle results detected by flow cytometry(n=3)

*P<0.01vs0 μg/ml group

2.4 RWPE-1和22Rv.1细胞核型变化

RWPE-1和22Rv.1细胞分别经0 μg/ml、10 μg/ml和20 μg/ml浓度的杨芽黄素作用24 h，hoechst 33342染色并通过荧光倒置显微镜观察后发现，22Rv.1细胞经10 μg/ml或20 μg/ml浓度的杨芽黄素作用后，部分细胞核染色质浓集，出现核碎裂和凋亡小体的现象，且发生核型改变的细胞比例随用药浓度增加而增加，由28 %增加至42 %。在杨芽黄素用药剂量为10 μg/ml时，正常前列腺细胞RWPE-1的细胞核型无明显改变，但当用药剂量达到20 μg/ml时，约30 %细胞的细胞核亦呈现染色浓集、核碎裂和凋亡小体的核型，因此后面基因和蛋白分析的实验中，以10 μg/ml杨芽黄素作用浓度作为用药剂量(图2)。

Fig.2The results of hoechst 33342 staining

2.5 乳酸脱氢酶释放实验检测结果

乳酸脱氢酶释放实验结果证实，2.5、5、10和20 μg/ml 杨芽黄素作用于22Rv.1细胞作用24 h后，乳酸脱氢酶释放率由未用药组的0.40%±0.02%增加到5.02%±0.03%、14.13%±0.07%、22.18%± 0.11%和43.31%±0.13%。因此杨芽黄素具有显著的细胞毒作用(P<0.01，n= 3)。

2.6 22Rv.1细胞内基因mRNA水平qPCR检测结果

QPCR检测结果表明(表3)，与0 μg/ml杨芽黄素用药组相比较，10 μg/ml杨芽黄素作用22Rv.1细胞24 h后，细胞内基因trail、p53、dr4、dr5、foxo3、caspase-3、caspase-8、caspase-9、bid和bax的转录水平显著上调(P<0.01，n= 3)，而akt、pi3k和bcl-2基因转录水平明显下降。

GenesThe ratio of 2-△△CT (Examination/Control)GenesThe ratio of 2-△△CT (Examination/Control)TRAIL4.32±0.14*p534.63±0.16*DR43.77±0.07*AKT0.38±0.04*DR56.59±0.05*PI3K0.43±0.03*FOXO3a3.45±0.14*Caspase-32.15±0.09*Bid4.32±0.20*Caspase-83.28±0.15*Bax3.26±0.14*Caspase-93.27±0.16*Bcl-20.47±0.04*

*P<0.01vs0 μg/ml group

2.7 Western blot检测22Rv.1细胞蛋白表达水平

22Rv.1细胞分别经0、5、10和20 μg/ml浓度的杨芽黄素作用24 h后，取细胞蛋白进行Western blot检测细胞内蛋白质水平，结果显示(表4)，杨芽黄素可促使22Rv.1细胞内TRAIL、P53、DR4、DR5、FOXO3、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bid和BAX蛋白的表达、活化，同时抑制抗凋亡蛋白AKT、PI3K和BCL-2的表达、活化，且作用效果与用药剂量有关。

The ratio of protein / β-Actin0 μg/ml5 μg/ml10 μg/ml20 μg/mlTRAIL0.11±0.080.36±0.03*0.52±0.06*0.97±0.02*DR50.07±0.090.28±0.08*0.65±0.07*1.07±0.09*DR40.06±0.050.18±0.06*0.46±0.02*0.88±0.05*Bid0.12±0.090.23±0.09*0.39±0.04*0.95±0.03*Bax0.09±0.110.18±0.06*0.57±0.08*1.07±0.02*Bcl-20.92±0.080.66±0.03*0.35±0.07*0.21±0.07*Caspase-80.01±0.010.14±0.11*0.29±0.10*0.74±0.06*Caspase-30.02±0.010.13±0.08*0.34±0.09*0.67±0.02*Caspase-90.03±0.010.12±0.07*0.32±0.11*0.49±0.09*PI3K1.19±0.070.68±0.06*0.21±0.05*0.15±0.02*AKT0.97±0.050.56±0.04*0.32±0.06*0.23±0.05*p530.04±0.010.17±0.08*0.41±0.09*0.76±0.02*FOXO3a0.05±0.010.27±0.03*0.45±0.06*0.69±0.04*

*P<0.01vs0 μg/ml group

2.8 抑瘤实验的结果

抑瘤实验结果显示，当用药剂量分别为1、5、25和125 mg/kg时，肿瘤抑制率分别为28.32%± 0.04%、61.17%±0.07%、72.06%±0.11%和81.29%±0.19%。因此，杨芽黄素可抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长。同时，杨芽黄素用药后，小鼠的存活期延长，当药物剂量达到25 mg/kg时，小鼠状态最好，且其生存期由未用药的(21.4±0.07)d延长到(107.2±0.1)d(P< 0.01,n=10)。但当药物剂量增加到125 mg/kg时，小鼠在用药18 d即有1只死亡，其余小鼠存活期较药物浓度为25 mg/kg时明显缩短(49.43±0.21 d)。

3 讨论

杨芽黄素作为一种植物提取物，本实验发现它对22Rv.1细胞具有显著的细胞毒作用。在杨芽黄素作用后，可以发现22Rv.1细胞增殖活性明显受抑，且细胞凋亡、死亡的比例明显增加，细胞周期阻滞，细胞核型向凋亡的核型转变。通过本实验的研究结果发现，杨芽黄素作用于22Rv.1细胞不仅促使死亡受体DR4、DR5基因高表达，而且使Caspase家族中的Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9转录和表达水平明显上升。Caspase家族与细胞凋亡途径密切相关，其中包括凋亡起始者Caspase-8、Caspase-9，以及凋亡的执行者Caspase-3。而已有研究表明TRAIL可以通过激活Caspase-8来启动线粒体信号通路，从而诱导肿瘤细胞发生凋亡，其机制就是通过TRAIL黏附于其受体，通过激活Caspase-8，从而触发线粒体途径，发出促使肿瘤细胞凋亡和死亡的信号[9]。本实验杨芽黄素作用的信号通路如图3所示，TRAIL与DR4、DR5受体结合，发出的信号激活下游蛋白Caspase-8，导致其效应物Caspase-3的激活，而Caspase-3使得bax基因与bcl-2基因表达失去固有的平衡，使得凋亡基因bax占主导地位，从而诱导肿瘤细胞发生凋亡。同时TRAIL在激活Caspase-8后，还通过线粒体依赖的内源性通路活化了bcl-2家族中的Bid蛋白，形成有活性的tBid并进入线粒体内，线粒体外膜的通透性发生改变，跨膜电位降低，线粒体内的Cytc释放到胞浆中。来自线粒体内的Cytc在胞浆中可与Apaf1相结合，促进Caspase-9活化，最终同样使得Caspase-3被激活，通过影响凋亡基因和抗凋亡基因的表达，促进22Rv.1细胞的凋亡。已有研究表明TRAIL在诱导22Rv.1细胞发生凋亡的同时对于人体正常的细胞并没有明显的杀伤作用[10]，这使得杨芽黄素通过TRAIL通路抗前列腺癌具有巨大的研究意义及临床前景。

有研究表明，PI3K/AKT信号通路在前列腺癌细胞中被激活，从而促进肿瘤的生长及转移，一但PI3K/AKT信号通路被抑制，前列腺癌的发展也会受抑[11-13]。而在本实验结果中发现在杨芽黄素作用下，22Rv.1细胞内PI3K和AKT的转录和表达水平显著下调，其通过抑制PI3K/AKT信号通路，从而促进22Rv.1细胞发生凋亡。且当PI3K/AKT通路被杨芽黄素抑制后，实验结果发现FOXO3磷酸化水平增高。FOXO3是一种与肿瘤发生发展密切相关的转录因子，它除可以通过调节与细胞周期、细胞凋亡相关基因的表达和磷酸化水平来诱导细胞凋亡和死亡外，尚能激活TRAIL通路[14,15]，进一步促使22Rv.1细胞发生凋亡。此外，杨芽黄素抑制PI3K/AKT信号通路后，还促进其下游基因p53的表达。p53是肿瘤抑制基因，它不仅在肿瘤发展中具有重要的作用，在细胞的衰老死亡过程中也扮演着重要的角色[16]。活化的p53能抑制抗凋亡基因bcl-2的表达、促进凋亡基因bax表达[17]，致使BAX/BCL-2的比例发生改变，诱导22Rv.1细胞发生凋亡，从而表现出一定的抗前列腺癌效应。

综上，本研究表明，杨芽黄素可以通过影响PI3K/AKT和TRAIL信号通路诱导前列腺癌细胞22Rv.1凋亡，并且这两种信号通路的作用相互联系，相互促进。本实验同时证实了杨芽黄素在2.5～10 μg/ml剂量下对正常前列腺细胞RWPE-1的影响不大，故使得杨芽黄素可作为一种高效低毒的化疗药物安全有效地应用于抗前列腺癌的治疗。

Fig.3The signal pathway oftectochrysin effect