相对校正因子法测定葡萄酒中农药残留

王百川，傅泽田，张小栓，王承国，孔维府，徐榕雪

(1.中国农业大学烟台研究院，山东烟台264000；2.中国农业大学工学院，北京100068）

葡萄在种植过程中不可避免要使用各类农药，国家相关法律法规对各种农药的适用范围和剂量都做出了严格的规定[1]，由于相关规范普及的不够到位，部分果农未按要求使用，或者施用农药的安全间隔期未到就进行采摘，导致原料中农药残留超标或者超范围。因此在葡萄酒酿造的过程就不可避免的引入这些农药，长期饮用此类产品会损害人体健康[2]。

目前检测农药残留的方法较为广泛，气质联用、液质联用、气相液相色谱、酶联免疫法等都有应用，其中质谱法以其高灵敏度、高选择性逐渐成为分析的主要手段，本文基于气质联用结合QuECh-ERS前处理方法开发校正因子法测定葡萄酒中多种农药残留的检测方法，为此类产品的农残监测提供技术手段[3-8]。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

耗材及试剂：甲霜灵、克菌丹、醚菌酯、戊唑醇、苯醚甲环唑标准品，100 μg/mL，购于北京曼哈格生物科技有限公司；乙腈、丙酮均为色谱纯，购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；PSA、C18、GCB粉购于博纳艾杰尔科技有限公司。

仪器设备：GC-MS/MS，TQ-8040，岛津中国有限公司；高速冷冻离心机，TGL-16，长沙湘智离心机仪器有限公司。

标准工作溶液：将5种农残标准品用丙酮稀释成浓度为10 μg/mL的标准储备溶液，冷藏备用。

基质匹配混合标准工作溶液：将标准储备溶液用空白样品提取液配成不同浓度的标准工作溶液,用于拟合标准工作曲线。

1.2 试验方法

1.2.1 样品制备方法

称取5.00 g混匀后的试样，置于50 mL离心管中，放入冰箱中冷藏20 min，加入3 mL色谱纯乙腈，振摇5 min，加入0.5 g氯化钠和2.5 g无水硫酸镁，涡旋1 min。8000 r/min冷冻离心5 min。取1 mL上清液加入装有50 mg C18、50 mg PSA、10 mg GCB、150 mg无水硫酸镁的离心管中，涡旋3 min，离心取上清液经氮吹浓缩至近干加入1 mL丙酮，0.22 μm有机滤膜过滤。

1.2.2 GC-MS/MS条件

进样口：250℃，高压不分流进样；毛细管柱：Rxi-5Sil MS，30 m×0.25 mm×0.25 μm，升温程序：初始温度50℃保持1 min，以20℃/min的升温速率升至280℃，保持10 min。恒线速度模式。进样体积：1 μL；载气：氦气，纯度＞99.999%。

溶剂延迟：5 min；接口温度：260℃，离子源温度：200 ℃；电离方式：EI，电离能量70 eV。

2 结果与分析

2.1 样品前处理

乙腈对绝大多数农药都有很好的相溶性，并且可以在提取的同时排除大部分的杂质，葡萄酒本身含有大量的糖分、色素、有机酸等干扰物质，QuEChERS方法中经常应用C18、PSA、GCB来减少此类物质的干扰，另外无水硫酸镁和氯化钠的加入，使得待测目标成分更有效的转移至有机相中，结合前期实验，最终确定了C18、PSA、GCB、无水硫酸镁和氯化钠的加入量。

2.2 色谱与质谱条件优化

在扫描离子模式下监测农残产生的碎片离子，结果见图1—图5。结合各离子丰度大小，优化碰撞电压，建立MRM方法，各目标物参数见表1。

图1 甲霜灵碎片离子质谱图

图2 克菌丹碎片离子质谱图

图3 醚菌酯碎片离子质谱图

图4 戊唑醇碎片离子质谱图

图5 苯醚甲环唑碎片离子质谱图

表1 目标物保留时间及MRM参数

2.3 方法检出限和定量限

检出限计算方法为3倍的S/N，10倍S/N作为定量限，结果见表2。

表2 线性范围和检出限

2.4 相对校正因子[9]

实验数据表明，甲霜灵在进样量为0.02～0.4 ng范围内，克菌丹在进样量为0.1～0.8 ng范围内，醚菌酯在进样量为0.02～0.4 ng范围内，戊唑醇在进样量为0.02～0.4 ng范围内，苯醚甲环唑在进样量为0.1～0.8 ng范围内，线性关系良好。以甲霜灵、克菌丹、戊唑醇、苯醚甲环唑线性回归方程斜率与醚菌酯之比，作为峰面积校正因子，同时考虑到实际检测过程中进样量、线速度、不同品牌柱子会对校正因子有些细微的影响，所以对其耐受性进行进一步的考察，结果见表3。

表3 校正因子耐受性

表3结果表明，当改变进样量、线速度、色谱柱等条件时，校正因子的波动性较小，耐受性较好，可以根据醚菌酯的测定结果，同时计算出其他4种农药残留的含量，达到一测多评的目的。

2.5 加标回收率

称取3份葡萄酒空白样品，加入甲霜灵、克菌丹、醚菌酯、戊唑醇、苯醚甲环唑标准溶液，按照样品处理方法制备，添加水平取0.02 mg/kg，计算方法的回收率和相对标准偏差，结果见表4。

表4 加标回收率及其相对标准偏差(n=3)

加标样品中5种农残总离子流色谱图见图6。

结果表明，空白样品加标提取检测后，各组分分离效果理想，回收率、精密度符合分析要求。

2.6 精密度

将0.3 μg/mL的5种农药混合标准溶液，连续进样6次，测定数据见表5。

表5结果表明，在该测定条件下，仪器精密度良好，符合分析要求。

图6 加标样品多反应监测色谱图

表5 精密度(n=6)

3 讨论

建立QuEChERS方法前处理样品，气质联用仪选择特征碎片离子同时检测葡萄酒中甲霜灵、克菌丹、醚菌酯、戊唑醇、苯醚甲环唑农药残留的方法，同时探索甲霜灵、克菌丹、戊唑醇、苯醚甲环唑相对醚菌酯校正因子的稳定性，以期达到一测多评的目的，实验结果表明,该方法具有简便、灵敏度高、校正因子相对稳定的特点，符合分析要求，并对分析检测葡萄酒中其他种类农药残留具有重要的借鉴意义。