高产酒精酵母的分离筛选及耐受性的研究

郑 虹，杜 可，韩艳丽，邓加聪

（1.福建师范大学福清分校海洋与生化工程学院，福建福清350300；2.现代设施农业福建省高等学校工程研究中心，福建福清350300）

随着我国经济的发展，我国对石油的需求日益膨胀，我国已成为第二大能源消耗国。据有关国际能源资料统计和专家预言，全球适合于经济开采的石油以及天然气资源只能再开采30～50年，而煤炭也只够开采300年[1]，因此寻找可再生的替代能源己迫在眉睫。

由于乙醇燃烧只产生水和二氧化碳，对环境不会造成污染，是一种清洁能源，而且生物燃料乙醇作为一种可再生能源[2-4]，具有很大的市场潜力。酿酒酵母是乙醇生产中最常用的发酵菌株，但是乙醇耐受性往往成为限制酿酒酵母乙醇产量的重要因素[5-6]，因此选育耐高温、耐高糖、耐高浓度乙醇的酵母菌株对于提高乙醇产率具有重要意义[7-11]。彭源德等[12]通过初筛、复筛和紫外诱变，筛选到1株编号为S-132的耐受性优良的酒精酵母，该酵母具有耐40℃高温和耐16%vol乙醇的能力。

本研究采用自然分离筛选的方法，从分离样品中获得耐高温、耐高糖、耐高浓度乙醇的酵母菌，为酒精生产节能降耗提供一种新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

混合菌粉，由龙岩沉缸酒厂提供；蛋白胨、酵母浸粉、葡萄糖、琼脂粉、三苯基四氮唑盐酸盐（TTC）等实验试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

YPD液体培养基（g/L）：蛋白胨20、酵母浸粉10、葡萄糖20，自然pH值。

平板分离培养基：YPD琼脂培养基。

初筛培养基（g/L）：TTC上层培养基，TTC 0.5，葡萄糖5。

TTC下层培养基：YPD琼脂培养基。

YFM发酵培养基(g/L)：葡萄糖150，酵母浸粉5，pH值5.0。

斜面保藏培养基：YPD琼脂。

1.2 主要仪器

SPX-150B-Z型生化培养箱，上海博讯实业有限公司；DHG-90 70A型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；THZ-C型台式恒温振荡器，太仓实验设备厂；W-CJ-2FD型超净工作台，苏州苏洁净化设备有限公司；GSP-9050MBE型隔水式恒温培养箱，上海博讯实业有限公司；TGL-16M型高速台式冷冻离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌粉的富集培养及菌株分离筛选

取1 g混合菌粉，接种于YPD液体培养基，30℃，120 r/min振荡培养24 h；用无菌蒸馏水将菌液稀释至 10-7、10-8、10-9，取上述梯度稀释液0.1 mL涂布于平板分离培养基，30℃倒置培养24 h；将分离得到的具有酵母菌典型菌落的菌株接种于试管斜面，备用。

1.3.2 高产酒精酵母的初筛

将上述挑选到的单菌落，点接于TTC下层平板培养基上，30℃培养24 h，待长出菌落后倒入TTC上层培养基，30℃下放置3 h，挑取颜色变深红的菌落接种于YPD试管斜面，编号、培养，4℃冰箱保存，备用。

1.3.3 高产酒精酵母的复筛

将初筛得到的菌株接种于YPD试管斜面，30℃活化培养24 h；将活化后的菌株接种于YPD液体培养基，以30℃、150 r/min振荡培养24 h；将培养后的种子液按5%接种量接种于YFM发酵培养基，30℃静置发酵72 h，观察菌株产气泡的快慢及产量，并测定发酵液中酒精含量。

1.3.4 培养时间对酒精酵母产酒精能力的影响

将复筛得到的菌株，接种于YPD试管斜面，30℃活化培养24 h；挑取1环接种于YPD液体培养基，以30℃、150 r/min振荡培养24 h；按5%接种量接种于100 mL YFM发酵培养基，30℃下静置发酵，每隔12 h取样测定发酵液的酒精度和OD600。

1.3.5 耐受性试验

（1）耐高温试验

将复筛得到的菌株，接种于YPD试管斜面，30℃活化培养24 h；挑取1环接种于YPD液体培养基，以30℃、150 r/min振荡培养24 h；按5%接种量接种于100 mL YFM发酵培养基，于不同温度下（30℃、35℃、40℃、45℃、50℃）静置发酵72 h；测定发酵液的酒精度和OD600。

（2）耐乙醇试验

将复筛得到的菌株，接种于YPD试管斜面，30℃活化培养24 h；挑取1环接种于YPD液体培养基，以30℃、150 r/min振荡培养24 h；按5%接种量接种于100 mL YFM发酵培养基，40℃下静置发酵72 h，测定发酵液的酒精度和OD600。乙醇起始浓度分别为 0、4%vol、8%vol、12%vol、16%vol、20%vol。

（3）耐糖性试验

将复筛得到的菌株，接种于YPD试管斜面，30℃活化培养24 h；挑取1环接种于YPD液体培养基，以30℃、150 r/min振荡培养24 h；按5%接种量接种于100 mL YFM发酵培养基，40℃下静置发酵72 h，测定发酵液的酒精度和OD600。葡萄糖起始浓度为 100 g/L、150 g/L、200 g/L、250 g/L、300 g/L、350 g/L。

1.3.6 酒精的测定方法

酒精浓度的测定采用酒精比重计法测定[11-12]。

2 结果与讨论

2.1 高产酒精酵母菌的分离筛选

从混合菌粉中分离筛选出50株单菌落，经TTC培养基初筛，获得5株颜色较深的菌株，菌株编号为 S-21、S-31、S-36、S-37、S-40。结果见图1。

图1 TTC培养基初筛

将初筛得到的5株酵母菌接种于发酵培养基，进行摇瓶复筛，结果见表1。

表1 不同酵母菌产酒精能力的比较

由表1可见，菌株生物量、产酒精和产气能力有一定的差异，生物量变化：S-21＞S-36＞S-40＞S-31＞S-37；产酒精能力为：S-21＞S-36＞S-40＞S-37＞S-31；产气能力为：S-21=S-40＞S-36=S-37＞S-31；其中菌株S-21、S-36、S-40的OD600值和产酒精能力均分别在1.3和8.0%vol以上，而且产气量也比较多。因此综合以上实验结果，选择菌株S-21、S-36、S-40进行以下实验。

2.2 培养时间对酒精酵母发酵性能的影响

将菌株S-21、S-36、S-40接种于发酵培养基，每隔一段时间取样测定发酵液的OD600，探索培养时间对酵母菌发酵及生长性能的影响。结果见图2。

图2 培养时间对酵母菌生长及产酒精性能的影响

由图2可见，菌株S-21、S-36、S-40的生物量和产酒精能力均随着培养时间的延长呈先升后降的趋势；当培养时间为72 h时，3株菌株的生物量和酒精度均达到最大值，分别为2.289、2.245、2.393和8.4%vol、9.4%vol、8.9%vol，之后随着培养时间的延长，菌株的生物量和发酵液中的酒精度减少。可能因为随着培养时间的延长，发酵液中营养成分的消耗及废弃物的积累，不利于菌株的生长；同时随着培养时间的延长，在培养过程中，发酵液中酒精的挥发，导致越到后面，发酵液中的酒精度反而越低。因此，3株菌株的最适发酵时间均为72 h。

2.3 酒精酵母耐受性的实验

2.3.1 酒精酵母耐高温试验

将活化后的菌株接种于液体发酵培养基，在不同温度下培养72 h，测定各菌株发酵液的OD600和酒精度，结果见图3。

图3 不同培养温度对酵母菌生长及产酒精性能的影响

由图3可见，不同菌株的生物量和产酒精能力有一定的差异。菌株S-21、S-36、S-40的生物量和酒精产量均随着培养温度的升高呈先升后降的趋势；在同一温度下，菌株S-36的生物量和酒精度均高于菌株S-21和S-40；当发酵温度为40℃时，菌株S-21、S-36、S-40的生物量和酒精产量均达到最高，菌株S-21、S-36、S-40的生物量分别为2.023、2.170、1.833，而酒精产量分别为8.3%vol、9.6%vol、8.5%vol，表明菌株S-21、S-36、S-40均为较好的耐高温酵母菌株。

2.3.2 酒精酵母乙醇耐受试验

将活化后的菌株接种于含有不同乙醇浓度的液体发酵培养基，40℃下培养72 h，测定各菌株发酵液的OD600，结果见图4。

图4 不同乙醇浓度对酵母菌生长的影响

由图4可知，随着发酵培养基中乙醇浓度的增加，菌株S-21、S-36、S-40的生物量均随着培养基中乙醇浓度的增加逐渐减少，表明高浓度的乙醇会抑制酵母菌的生长发育；当乙醇浓度一致时，菌株S-36的生物量均高于菌株S-21和菌株S-40，说明菌株S-36的生长繁殖情况比其余两株菌好，对乙醇具有更好的耐受性。总之，菌株S-21、S-36、S-40均具有较好的乙醇耐受性。

2.3.3 酒精酵母糖浓度耐受试验

将活化后的菌株接种于含有不同葡萄糖浓度的液体发酵培养基，40℃下培养72 h，测定各菌株发酵液的OD600和酒精度，结果见表2。

由表2可见，菌株S-21、S-36、S-40的生物量和酒精度均随着培养液中葡萄糖浓度的增加呈先升后降的趋势；在同一葡萄糖浓度的发酵液中，菌株生物量和酒精度的大小顺序均为S-36＞S-21＞S-40；当培养基中葡萄糖浓度从150 g/L上升到200 g/L时，3株菌的生物量和酒精产量均大幅度上升，当发酵液中葡萄糖初始浓度为200 g/L，3株菌的生物量和酒精度均达到最大值，菌株S-21、S-36、S-40的生物量分别为2.029、2.134、2.016，而酒精产量分别为 8.5%vol、9.7%vol、8.2%vol，当葡萄糖浓度从200 g/L到300 g/L，3株菌的生物量和酒精度变化均不大。总之，3株菌均有较好的耐糖性。

表2 初始葡萄糖浓度对酵母菌生长和酒精产量的影响

3 结论

经过酵母菌的分离试验，初步筛选、复筛，探究培养时间对酵母菌发酵性能的影响以及酵母菌的耐受性等一系列试验可得出以下结论：

（1）经过酵母菌的富集培养、继代培养，通过TTC平板显色实验，筛选得到5株显色较深的酵母菌，然后经过产气和产酒精能力复筛最终得到菌株S-21、S-36、S-40这3株产气和产酒精能力较强的酵母菌。

（2）对这3株菌的耐受性实验研究，发现这3株菌可耐40℃高温，耐200 g/L高糖，耐20%vol高乙醇浓度的能力。