灯盏乙素调节ATP敏感性钾通道对抗β-淀粉样蛋白的毒性作用

王宁慧 伍棋 于燕妮 郭莉莉

(1贵州医科大学，贵州 贵阳 550004；2贵阳市第一人民医院)

阿尔茨海默病(AD)的病理机制与β-淀粉样蛋白(Aβ)的多个神经毒性机制密切相关，这些毒性机制之间相互影响，互为调节，形成一个复杂的多因素循环作用，贯穿在整个疾病进程中。Aβ作为疾病致病分子的认识多年来得到公认，虽然针对Aβ设计的靶向临床药物并未取得治疗上的突破，然而研究者们却得到了在治疗上应针对Aβ毒性而非单纯针对Aβ本身的重大提示〔1,2〕。致力于多个靶点的毒性对抗，降低Aβ神经毒性以期延缓AD进程，仍然是AD的主要治疗策略之一。课题组利用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术获取了AD双转基因动物脑组织中Aβ毒性相关的差异蛋白点，同时观察到灯盏乙素(Scu)主要调节了其中12个差异靶蛋白点的疗效，包括ATP敏感性钾通道(KATP)蛋白〔3〕。分化成熟的人源性神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞具有神经元的形态和特性，并表达神经元特异性标志物，往往被用来制作神经系统疾病的细胞模型〔4〕，本实验利用该细胞株制作Aβ毒性诱导的反映AD病程的细胞模型，进一步验证并探讨Scu介导KATP路径对抗Aβ神经毒性的疗效及作用机制。

1 材料与方法

1.1实验药物及细胞 实验Scu为浅棕色粉末(批号：ZL20161012037，纯度98%)，由南京泽朗生物医药科技公司提供；Aβ1～42寡聚体购自Sigma公司(编号：A9810)；二氮嗪(DZ)购自Sigma公司(编号：D9035)；SH-SY5Y细胞购自中国科学院昆明细胞生物研究所(编号：KCB2006107YJ)。

1.2主要试剂与仪器 CCK8试剂购自同仁公司(日本)；多克隆兔抗Kir6.1购自GenTex公司(美国)；多克隆兔抗Kir6.2、SUR1、SUR2购自Abcam公司(美国)；β-actin抗体购自CST公司(美国)；Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；DiBAC4(3)荧光探针购自北京索莱宝科技有限公司；线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)和ATP检测试剂盒购自碧云天生物技术公司。多功能酶标仪(美国Thermo Fisher公司)；流式细胞仪(美国Beckman Couler公司)；蛋白质凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。

1.3方法

1.3.1药物制备 Aβ1～42用六氟异丙醇(HFIP)进行充分溶解并分装，通风橱过夜风干，-80℃保存待用，使用前加二甲基亚砜(DMSO)溶解， 用不含酚红的DMEM/F12细胞培养液稀释成每管10 μmol/L，4 ℃冰箱放置24 h，离心后取上清使用〔5〕；Scu和DZ 在使用前精确称量分装，再用DMEM细胞培养液充分稀释，0.22 μm微孔注射滤器过滤后使用。

1.3.2细胞培养及分组处理 SH-SY5Y细胞培养，培养液为DMEM高糖培养基，添加12%胎牛血清，1%双抗，培养箱条件为37℃、5% CO2，将细胞转入细胞培养板中，分为对照组、Scu处理组、Aβ处理组、Scu+Aβ处理组、DZ+Aβ处理组。对照组不加药物处理；Scu处理组加入Scu(10 μmol/L)培养48 h；Aβ处理组加入Aβ1～42(1 μmol/L)培养24 h；Scu+Aβ处理组、DZ+Aβ处理组分别加入Scu(10 μmol/L)、DZ培养24 h，再加入Aβ1～42(1 μmol/L)培养24 h。

1.3.3CCK-8法筛选药物浓度 将细胞以1×105个/ml的密度接种于96孔板，每孔100 μl，单加磷酸盐缓冲液(PBS)作为阴性对照，细胞贴壁后进行不同浓度DZ(0、100、200、250、500、1 000、2 000 μmol/L)的加药处理，继续培养48 h后加入CCK-8试剂，CCK-8试剂用DMEM细胞培养液以1∶10 的比例稀释后，每孔100 μl均匀加入，放置培养箱孵3 h后用多功能酶标仪测定450 nm处OD值，根据公式存活率=(实验组-空白组)/(对照组-空白组)计算各组细胞存活率。Aβ及Scu的浓度同之前的检测方法和结果〔6〕。

1.3.4生物化学方法检测各组ATP含量 将细胞接种于6孔板中，24 h贴壁后进行分组处理。各组细胞分别加入200 μl/孔的裂解液裂解细胞，4℃ 12 000 r/min离心5 min，取上清待用。将100 μl/孔 ATP检测工作液加入96孔板中，室温放置3～5 min，再加入上述上清或标准品，多功能酶标仪(化学发光)检测，根据标准曲线计算样品中ATP含量。

1.3.5Western印迹检测各组细胞KATP通道亚基内向整流钾通道(Kir)6.1、Kir6.2、磺酰脲受体(SUR)1、SUR2的蛋白表达水平 收集各组细胞，加入蛋白裂解液，4℃裂解1 h，4 ℃ 12 000 r/min离心20 min，取上清并进行BCA蛋白定量，聚丙烯酰胺凝胶电泳后转于PVDF膜上，各指标一抗和二抗孵育后曝光显影。以β-actin蛋白作为内参照，用ImageJ 软件对图像进行灰度分析，结果以各指标条带与β-actin条带灰度的比值作为各指标蛋白的相对表达量。

1.3.6DiBAC4(3)荧光探针法检测各组细胞细胞膜电位 将细胞以1×105个/ml的密度接种于96孔板中，24 h细胞贴壁后进行分组处理后分别加入180 μl的5 μmol/L DiBAC4(3)的检测用缓冲液，在5%CO2，37℃培养箱中孵育30 min，孵育结束后再加入20 μl的5 μmol/L DiBAC4(3)的检测用缓冲液，用多功能酶标仪(激发光488 nm，发射光517 nm，孵育温度37℃)观察各组细胞的荧光强度变化。

1.3.7JC-1荧光探针法检测各组细胞线粒体膜电位 将细胞以1×105个/ml的密度接种于96孔板中，24 h细胞贴壁后进行分组处理。各组细胞分别加入50 μl/孔细胞培养液和50 μl/孔JC-1染色工作液，充分混匀，细胞培养箱37℃孵育20 min，孵育结束后吸除上清，用JC-1染色缓冲液洗涤2次，最后加入100 μl/孔细胞培养液，多功能酶标仪检测JC-1聚合体(激发光525 nm，发射光590 nm)和JC-1单体(激发光490 nm，发射光530 nm)荧光值，线粒体膜电位用JC-1单体荧光值/JC-1聚合体荧光值作为相对比值进行计算统计。

1.3.8流式细胞仪检测各组细胞凋亡率 将细胞接种于6孔板中，24 h贴壁后进行分组处理。用不含EDTA的胰酶(200 μl/孔)消化收集细胞，PBS洗涤细胞两次后，用500 μl上样缓冲液悬浮细胞，再依次加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl碘化丙啶混匀，室温避光放置15 min，在1 h内采用流式细胞仪进行凋亡检测，利用Flow-Jo流式分析软件，计算细胞总凋亡率。

1.4统计学方法 采用SPSS21.0 软件进行单因素方差分析和秩和检验。

2 结 果

2.1不同浓度DZ对SH-SY5Y细胞增殖活性的影响 浓度为0、100、200、500、1 000、2 000 μmol/L的DZ作用于SH-SY5Y细胞48 h后的细胞存活率分别为(100.00±0.00)%、(103.47±8.16)%、(92.36±3.38)%、(65.32±3.75)%、(48.81±4.26)%、(30.31±5.54)%。0～200 μmol/L DZ作用于细胞48 h后细胞增殖活性无明显变化，500～2 000 μmol/L作用后细胞的增殖活性呈不同程度的下降，毒性作用呈剂量-效应关系，差异有统计学意义(P<0.01)，选择200 μmol/L作为DZ实验用浓度。

2.2各组细胞ATP含量 与对照组〔(9.57±0.62)nmol/mg〕和Scu处理组〔(9.86±1.18)nmol/mg〕相比，Aβ处理组〔(6.84±0.68)nmol/mg〕ATP含量明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)；Scu干预后〔Scu+Aβ处理组(8.78±0.73)nmol/mg〕，ATP含量有所升高，差异有统计学意义(P<0.05)；DZ干预后〔DZ+Aβ处理组(7.22±0.30)nmol/mg〕，ATP含量也有所升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3Kir6.1、Kir6.2、SUR1、SUR2的蛋白表达 与对照组和Scu处理组相比，Aβ处理组Kir6.1、SUR2的蛋白表达上调，差异有统计学意义(P<0.01)，Kir6.2、SUR1的表达无明显变化；Scu干预后，Kir6.1、SUR2的蛋白表达下调，差异有统计学意义(P<0.01)，未见Kir6.2、SUR1的表达变化。DZ+Aβ处理组的表现与Scu+Aβ处理组基本一致。见表1，图1。

1～5:对照组;Scu处理组;Aβ处理组；Scu+Aβ处理组；DZ+Aβ处理组图1 各组细胞中Kir6.1、Kir6.2、SUR1、SUR2蛋白表达水平

组别Kir6.1Kir6.2SUR1SUR2对照组0.65±0.060.86±0.060.53±0.060.68±0.05Scu 处理组0.64±0.140.86±0.160.54±0.090.66±0.12Aβ处理组1.09±0.231)0.84±0.060.55±0.031.02±0.081)Scu+Aβ处理组0.74±0.122)0.88±0.140.56±0.050.76±0.072)DZ+Aβ处理组0.67±0.162)0.85±0.120.57±0.050.77±0.102)

与对照组比较：1)P<0.01；与Aβ处理组比较：2)P<0.01

2.4各组细胞细胞膜电位变化 与对照组(6.86±0.05)和Scu处理组(6.79±0.05)相比，Aβ处理组(7.38±0.14)的荧光值有所升高，差异有统计学意义(P<0.05)，表示细胞膜膜电位升高，呈现去极化现象；而与Aβ处理相比，Scu+Aβ处理组(6.86±0.20)的荧光值趋向于正常，但差异有统计学意义(P<0.05)，表示膜电位的去极化现象有所改善。DZ+Aβ处理组(6.90±0.33)的表现与Scu+Aβ处理组基本一致。

2.5各组细胞线粒体膜电位变化 与对照组(1.03±0.07)和Scu处理组(1.03±0.04)相比，Aβ处理组(1.43±0.02)的荧光值有所升高，但差异仍有统计学意义(P<0.01)，表示细胞膜膜电位升高，呈现去极化现象；而与Aβ处理相比，Scu+Aβ处理组(1.23±0.05)的荧光值趋向于正常，但差异仍有统计学意义(P<0.01)，表示膜电位的去极化现象有所改善。DZ+Aβ处理组(1.22±0.04)的表现与Scu+Aβ处理组基本一致。

2.6各组细胞总凋亡率 与对照组(4.18%±0.63%)和Scu处理组(4.25%±0.42%)相比，Aβ处理组(17.58%±0.48%)细胞总凋亡率明显增加，差异有统计学意义(P<0.01)；Scu干预后，细胞总凋亡率(11.23%±0.84%)明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)。DZ+Aβ处理组(9.67%±1.03%)的表现与Scu+Aβ处理组基本一致。

3 讨 论

KATP是一种与细胞能量代谢密切相关的配体门控钾通道，受腺苷酸的调节直接将细胞的代谢状态与电活动相耦联，在神经系统中起神经元保护作用〔7〕。细胞内ATP是KATP通道的主要调节剂，通道的开闭直接受其调控，正常细胞胞质内ATP浓度约为10 nmol/mg蛋白，此时KATP处于稳定状态，当细胞受到内外环境刺激时，胞质内ATP浓度发生适应性下降，触发KATP开放。细胞膜上的KATP开放时，K+外流，细胞膜超极化，抑制细胞膜上电压依赖性离子通道的开放，比如抑制电压依赖性钙离子通道，可减少钙内流，减少细胞内钙超载诱发的凋亡，同时也能减少动作电位的发生，减少能量消耗；线粒体膜上的KATP开放时，线粒体膜超极化，可维持线粒体膜电位，稳定线粒体体功能，抑制线粒体通透性转换孔(MPTP)的开放，减少氧自由基和凋亡启动因子释放，进而减少氧化应激损伤和凋亡发生〔8〕。我们在实验中发现，Aβ的毒性刺激使细胞内ATP的浓度明显下降，细胞膜和线粒体膜电位呈现去极化改变，表明Aβ刺激了ATP调节下的KATP开放，神经元细胞发生保护性自主调节的生物学行为，然而，细胞凋亡率的增加，代表这种适应性反应远不足以抵消Aβ造成的细胞损伤。

KATP主要分布在神经元、胰腺β细胞、骨骼肌细胞及平滑肌细胞的细胞膜和线粒体膜表面，由4种Kir和4种SUR组成，Kir家族形成通道孔，Kir6为ATP敏感，目前确定的有Kir6.1和Kir6.2两种亚基，SUR为ATP结合蛋白的“超家族”，构成通道调控元件，包括SUR1和SUR2两种亚基。研究发现，KATP通道亚基在脑内广泛表达(包括在与认知能力密切相关的海马区域，海马区主要以Kir6亚基表达为主)〔9〕，我们同样观察到实验用神经元细胞中均呈现出Kir6.1、Kir6.2、SUR1和SUR2的蛋白表达，且Aβ的处理引起了Kir6.1和SUR2的蛋白表达上调，对Kir6.2和SUR1的蛋白表达并无影响，代表Aβ触发的KATP通道开放选择性作用于Kir6.1/SUR2亚基。与此同时，我们观察到在Scu干预后，Aβ刺激下细胞内ATP的浓度水平与细胞膜和线粒体膜电位的变化趋向于正常，Kir6.1和SUR2的蛋白表达下调，细胞总凋亡率明显下降，显示出Scu可能通过调节KATP通道蛋白Kir6.1/SUR2亚基的表达，或者是降低KATP通道对细胞内ATP的敏感性而激活了通道开放，在Aβ的毒性影响下发挥神经元保护作用。

KATP通道现已成为包括神经变性性疾病在内的多种疾病的治疗靶点，多种KATP通道开放剂(KCOs)被应用于临床并取得较好疗效，不同类型的KCOs通过不同方式选择性作用于KATP通道蛋白〔10〕。二氮嗪(DZ)作为KCOs的一种类型被证实可以用来延缓Aβ毒性导致的细胞损伤〔11〕，有研究显示其可激活心肌细胞膜上的Kir6.1/SUR2亚型KATP通道来介导对心肌缺血再灌注损伤的保护，实验中DZ对ATP浓度的影响无统计学意义，可能与其主要是增加细胞内二磷酸腺苷(ADP)的浓度有关。我们观察到Scu发挥了与DZ基本相一致的作用，提示Scu存在作为KCOs应用来降低Aβ毒性的可能。

课题组在同期实验中观察到，Scu能够通过干预APP代谢的β分泌酶途径来抑制Aβ的生成〔12〕；能够通过对IP3R-Ca2+途径的调控和介导MPTP的开放来抑制Aβ毒性所致的细胞凋亡〔13〕；能够调节Aβ毒性所致神经元中组蛋白H2A、H2B、H3的表达，通过改变AD表观遗传的信息异常来发挥预防和治疗作用〔14〕等。综上所述，我们推测其还可能通过调控ATP介导的KATP通道开放来抑制Aβ毒性所致的细胞凋亡，从而发挥神经元保护作用，本实验为药物针对Aβ毒性在AD治疗中产生积极影响提供了新的实验依据。