花胚胎发育观察

王 静， 方富贵， 孟 轲， 乔刘鑫， 孔浩强， 郭 晗， 张益民， 刘慧芬， 李学军

（河南师范大学水产学院河南省水产动物养殖工程技术研究中心河南新乡453007）

花鳍骨（Hemibarbus maculatusBleeker）隶属于鲤形目（Cypriniformes）、鲤科（Cyprinidae）、鮈亚科（Gobioninae）、鳍骨属（Hemibarbus），俗称花骨鱼、季郎鱼，分布广，肉质细嫩，味道鲜美，蛋白质含量高，深受消费者喜爱。近年来，随着消费需求的增长，我国各地陆续开展了花鳍骨的人工繁殖，食性、营养等方面的研究，对胚胎发育的研究较少，因此本实验进行了观察和记录，旨在对花鳍骨早期生活史进行初步探讨，从而为其苗种生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 亲鱼来源与培育

亲鱼来自郑州市黄河湿地繁育场，暂养于水泥池，采用自然水温流水培育，用沉性颗粒饲料和甲鱼料按一定比例混合投喂，期间适当添加复合维生素，日投喂3 次，培育3个月。

1.2 人工授精和孵化

2019年5月进行人工催产，使用马来酸地欧酮（domperidon DOM） 和促黄体素释放激素类似物（Luteinzing Hormone Releasing Hormone -analogue LRH-A2）。雌鱼催产药物用量为每千克体重1 mg 的DOM和2 μg的LRH-A2，雄鱼剂量减半，注射于胸鳍基部。采用干法人工授精，每2尾雌鱼卵子与1尾雄鱼精液结合，将受精卵撒入网箱内，静水孵化。孵化期间水温控制在24 ℃～26 ℃，及时清除死卵，防止水霉发生。

1.3 胚胎发育处理

花鳍骨产粘性卵，遇水后膨胀，表面由一层膜包被，使胚胎不易观察。采用三种方法对胚胎进行处理观察：

（1）用4% 的多聚甲醛固定, 卵膜透明后置于生理盐水中，用尖头镊子剥去卵膜，拍照观察；

（2）受精后的胚胎立即用滑石粉脱粘，清水洗涤数次，至水溶液澄清后拍照；

（3）将受精卵直接洒在盛有蒸馏水的培养皿里，显微镜下观察。

1.4 胚胎发育观察

参照《水产动物组织胚胎学》的方法[2]，将受精卵用吸管均匀洒在装有蒸馏水的培养皿中，每个时期选取30个样本，发育时序以50%的胚胎发育至某个时期的时间计算，用蔡司倒置显微镜进行拍照观察。

2 结果与分析

2.1 花鲒骨胚胎发育观察方法比较

因花鳍骨为粘性卵，遇水后粘性增大，产生不透明的卵膜，因此在胚胎发育观察中存在难题，3种胚胎处理方法显示，将受精卵直接置于蒸馏水中，透明度高，拍照效果最好（图1-3）；而经滑石粉脱粘后，外部附着颗粒，致使卵膜灰黑，不易观察（图1-2）；用4%多聚甲醛固定后，虽然内部结构清晰可见，但死亡后的胚胎用尖头镊子剥去卵膜，内含物易流出，形态结构易发生改变，无法得到完整的胚胎（图1-1）。因此本实验观察花鳍骨的胚胎发育采用不脱粘的受精卵，蒸馏水孵化。

图1 胚胎观察不同前处理方法Fig.1 Different methods of embryo pretreatment were observed

2.2 胚胎发育过程

根据顾若波[1]前期对花鳍骨胚胎发育的研究，结合实验观察，水温控制在24 ℃，将其分为受精卵形成时期、卵裂时期、囊胚时期、原肠胚时期、神经胚期时期、器官形成期、出膜期（表1）。

表1 花鲜骨胚胎各期发育特征Table.1 Embryonic development characteristic periods of Hemibarbus maculatus

2.2.1 受精卵形成时期花鳍骨受精卵呈卵圆形，卵径为2.43 mm-3.44 mm，亚麦色，成胚盘（图2-1）。

2.2.2 卵裂时期

受精后1 h 10 min，胚盘从中间一分为二，顶部中央出现1纵裂沟，进入2细胞期（图2-2）。40 min之后，第2次卵裂开始，4个细胞前后交错排列为2排，两两垂直，即4细胞时期（图2-3）。受精后2 h 10 min，4细胞分裂成8个细胞，大小相似，整齐排列，分裂面与第1次平行，此时期称8细胞期（图2-4）。第4次分裂完成于受精后2 h 40 min，在第2分裂面的两侧产生与之平行的分裂沟，细胞个数为16个，胚盘进入16细胞期（图2-5）。受精3 h 10 min，细胞进入32细胞期，大小不一，排列不规则（图2-6）。细胞持续分裂，并且速度加快，数目越来越多，重叠紧密，差异明显，受精3 h 40 min，发展到64细胞期（图2-7）。随后，卵裂向多个方向进行，数量逐渐增多，细胞界限分辨不清，个体越来越小，进入多细胞期（图2-8）。

2.2.3 囊胚时期

在受精4 h 20 min后，细胞持续分裂，并且越分越细，肉眼难以计数，集聚在胚盘上方形成隆状结构，进入囊胚早期（图2-9）。随着时间的推移，细胞不间断地分化，隆起细胞与胚盘各占卵的1/2，此时期为囊胚中期，又称高囊胚期（图2-10）。之后一段时间，细胞与胚盘界限模糊，胚层开始慢慢下包胚盘，胚盘为椭圆状，到达囊胚晚期（图2-11）。

2.2.4 原肠胚时期

受精10 h后，胚层细胞下包卵黄的1/3，可观察到一个环状结构称胚环（图2-12），是原肠早期的典型特征。受精13 h 30 min后，胚层细胞下包卵黄的1/2时，似在胚盘上方加盖一帽子，与此同时胚盾出现，到达原肠中期（图2-13）。胚层细胞继续下包卵黄的2/3时，胚盾开始伸长，标志着原肠晚期的到来（图2-14）。

2.2.5 神经胚时期

在受精20 h 40 min后，胚层细胞下包卵黄的4/5时，胚层贴在胚盘上，并且胚环慢慢缩小，进入神经胚时期（图2-15）。2 h 10 min后胚层细胞完全包住卵黄，胚孔闭合，上端略微突起，为胚孔闭合期（图2-16）。

2.2.6 器官形成时期

在胚孔闭合35 min后，胚体周围开始分化，头部开始突起，四周会依稀出现肌节，包裹着胚体，为肌节形成期（图2-17）。1 h 5 min后，清晰观察到四对肌节（图2-18），25 min后形成八对肌节（图2-19），随着发育肌节数增加，进入多肌节期（图2-20）。在脑部的两侧浮现出眼泡并隆起产生眼肌，称眼肌期（图2-21）。眼部边缘靠近前侧形成椭圆状眼囊，称眼囊期。在眼的前方有一圆形板状结构叫嗅板，依附在头部两侧靠近眼囊，称嗅板期。进一步观察发现，胚体尾部微微向上翘起，眼睛扩大，称尾鳍出现期（图2-22）。在此基础上，尾鳍慢慢弯曲为芽状，肌节25-27对，胚体的形态发生较为明显的变化，称尾芽期（图2-23）。在受精52 h 31 min后，当肌节达到28对时，头部附近1-3对肌节开始缓慢收缩，称肌肉效应期（图2-24）。眼部周围发现有一透明圆形状晶体，称晶体出现期。1 h 17 min后，心脏出现，细长管状，眼的前部下方有半椭圆状组织，称鼻窝期（图2-25）。肌节30对时，听囊出现，附带一对不透明的白色亮点，称耳石期（图2-26）。尾部在胚体内占有一半的空间，尾摆的频率加快，每分钟5个周期，每个周期摆动3次，并且带动胚体在膜内顺时针转动，以此循环，称心脏搏动期（图2-27,28）。

2.2.7 出膜期

受精66 h后，肌节停止分化达到30对，胚体蜷缩在膜内，转动5 次/min，心脏跳动6 次/min，尾摆15 次/min，慢慢胚体运动速度加快，从顺时针转动到翻转、跳跃，卵越来越接近透明，胚体的每个器官依稀清楚可见，卵膜软化。5 min后胚体尾部穿破卵膜，透出小尾巴，此时刻胚体开始在膜内挣扎，躯干部猛烈抖动，心脏搏动频率加快，头部左右摇晃，开始挣脱卵膜的包被束缚，3 min后头部挣脱出卵膜，2 min后躯干部出膜，仔鱼出现称出膜期（图2-29,30）。

2.2.8 出膜后发育

仔鱼出膜后，眼部积累较多黑色素，为眼球色素出现期（图2-31）。

图2 花鲜骨胚胎发育观察Figure.2 Observing embryonic development of Hemibarbus maculatus

（1）受精卵；（2）2细胞期；（3）4细胞期；（4）8细胞期；（5）16细胞期；（6）32细胞期；（7）64细胞期；（8）多细胞期；（9）囊胚早期；（10）囊胚中期；（11）囊胚晚期；（12）原肠胚早期；（13）原肠胚中期；（14）原肠胚晚期；（15）神经胚期；（16）胚孔闭合期；（17）体节形成期；（18）四肌节期；（19）八肌节期；（20）多肌节期；（21） 眼肌出现期；（22） 尾鳍出现期；（23） 尾芽期；（24）肌肉效应期；（20）晶体出现期；（25）鼻窝期（26）耳石期；（27-28）心脏搏动期；（29-30）出膜期；（31）眼球色素出现期。

(1)fertilized egg;(2)2 cell phase;(3)4 cell phase;(4)8 cell phase;(5) 16 cell phase;(6) 32 cell phase;(7) 64 cell phase;(8) multicellular phase;(9) early blastocyst stage;(10) blastocyst metaphase stage;(11) late blastocyst stage;(12) early gastrula stage;(13) middle gastrula stage;(14)late gastrula stage; (15) neurula stage; (16) blastopore closed stage;(17) appearance of myomere stage;(18) four myomere stage;(19) eight myomere stage;(20) multi-myomere stage;(21)muscle effector phase;(22)caudal fin emergence stage;(23) tail bud stage;(24) muscle response period;(20) appearance of crystal stage;(25) nasal fossa stage (26) otolith stage;(27-28) cardiac pulse period;(29-30) membrane stage;(31) stage of appearance of eye pigment.

3 讨论

3.1 花鲒骨胚胎发育观察处理方法

自然界的鱼类的产卵类型可分为3类，浮性卵，能漂浮在水面；沉性卵，卵的比重大于水；粘性卵，遇水后吸附在水草等物体上[3]。常见的四大家鱼“青鱼（Mylopharyngodon piceus）、草鱼（Ctenopharyngodon idellus）、鲢（Hypophthalmichthys molitrix）、鳙（Aristichthys nobilis）”产漂流性卵，而同属于鲤科鱼的花鳍骨则产粘性卵。大多数粘性卵需要经过不同的胚胎观察前处理，黄金善用甲醛处理虹鳟（Oncorhynchus mykiss）得到较好的效果[4]；柳爱莲将斑马鱼（Danio rerio）的胚胎用波恩式液固定，琼脂糖包埋，石蜡切片，观察早期胚胎发育形态变化[5]。对于花鳍骨粘性卵的处理方法在之前也有报道，顾若波曾尝试用0.1mol/L的盐酸溶液短时间浸泡、0.3%的胰蛋白酶处理卵膜和5%甲醛固定，发现3种方法各有弊端，盐酸处理后效果最好[1]。对本实验所采用的方法而言，将未经脱粘处理的胚胎置于蒸馏水中，静水孵化，拍照效果最佳；滑石粉脱粘后，细小颗粒物质包裹卵表面，建议观察花鳍骨胚胎发育时最好不做脱粘处理，这一点与顾若波的观点相符合。

3.2 花鲒骨的胚胎发育特点

温度、光照和溶氧等外界条件都可以影响鱼类胚胎发育的过程，在水温20 ℃左右，似刺鳊鮈（Paracanthobrama guichenoti）受精卵需要95 h 08 min孵化出膜，而温度在23 ℃-26 ℃时，则需要78 h07 min，温度越高孵化时间越短[6]。这一现象也出现在花鳍骨水温18 ℃时，花鳍骨受精卵出膜需要110 h；水温20 ℃左右，71 h出膜；本实验温度控制在26 ℃，从受精卵到卵黄囊仔鱼历时66 h，孵化期间累计积温为1716 ℃·h，少于俞小先的报道[7]，发育到囊胚期、原肠胚和肌肉效应期相对较长，与同一亚科的似刺鳊鮈相似，初步推断温度可以影响花鳍骨的胚胎发育速度[8]。

3.3 花鲒骨胚胎发育时相划分

花鳍骨胚胎发育特点与大部分鲤科鱼类相同，不同地域群体繁殖出的后代发育过程中存在差异，顾若波以购自江苏太湖的亲本为实验对象，受精50 h后，在眼杯口出现圆形晶体，2 h 30 min后，胚胎开始表现出微弱的肌肉收缩，晶体清晰，发育至肌肉效应期[1]。本实验亲鱼来自河南黄河湿地，发育过程中先观察到肌肉效应期，而后形成晶体出现期。唐鱼尾泡消失时进入肌肉效应期[9]，而稀有鮈鲫（Gobiocyprisrarus）尾泡停留时间较长[10]。造成此现象的原因，可能是由于地域环境差异引起的。花鳍骨出膜方式是尾巴先破膜，靠身体摆动，不断拍击卵膜，随后头部伸出膜外，与似刺鳊鮈[6]和圆斑星鲽（Verasper variegatus）相反[11]。而造成此现象差异的原因有待进一步探讨。