我国鱼类精子超低温冷冻保存的研究进展

黄梦璐， 王 洁， 王 磊

（河南师范大学水产学院，河南新乡453007）

鱼类精子超低温冷冻保存技术对于鱼类种质资源保存、遗传多样性保护、新品种选育等均具有重要意义。利用这一技术建立冷冻精子库，可以解决雌雄发育不同步和远距离不同物种间杂交等难题。20世纪50年代，英国学者Blaxter等[1]首次冷冻保存了大西洋鲑的精子，并且获得了80%的受精率。我国的鱼类精子冷冻保存研究开始于20世纪50年代，到目前为止，我国研究人员先后成功保存了江鳕(Lota lota)[2]、刀鲚(Coilia ectenes)[3]、美洲鲥鱼(Alosa sapidissima)[4]、小黄鱼 (Larimichthys polyactis)[5]、哲罗鲑(Hucho taimen)[6]和双斑东方鲀(Takifugu bimaculatus)[7]等鱼类精子。但是，目前这一技术仍面临许多问题，一方面，精子冷冻保存的最适稀释液及浓度、最适抗冻剂及浓度等筛选步骤较繁琐，缺少自动化筛选仪器；另一方面，鱼类精子冷冻保存效果的评价体系有待完善。为解决上述问题，本文分析了超低温保存鱼类精子的相关报道，并进行了归纳总结，以期为后续的相关研究提供一定的理论指导。

1 稀释液

稀释液可以为精子提供适宜的存活环境、营养，同时还可以降低抗冻剂对精子的毒害作用。近年来，我国学者对鲽形目、鲶形目和鲤形目等鱼类进行了精子冷冻保存实验（表1），其中应用较多的稀释液有Hank’s 盐溶液（HBSS）和D-15，其次是鱼用任氏液，而Ringer液、MPRS和D-17等应用较少。研究发现，Hank’s盐溶液较适用于鲈形目鱼类精子的保存，D-15或D-15改良液适用于鲤形目鱼类精子的保存。

表1 鱼类精子冷冻保存常用的稀释液、抗冻剂和稀释比例Tab1 The dilute solution, cryopretectant and dilution rate of fish sprm commonly used in cryopreservation

续表

2 抗冻剂

抗冻剂可以减少冰晶对精子结构的损伤，延长精子的寿命。目前常用的抗冻剂为渗透性抗冻剂，如二甲基亚砜（DMSO）、甲醇（MeOH）、丙二醇（PG）、乙二醇（EG）、甘油（Gly）等。近年来，我国学者在进行鱼类精子超低温冷冻实验时对抗冻剂的使用情况如表1所示，统计发现最常用的抗冻剂为DMSO，浓度约为5%～15%[16,23]；其次是EG，浓度约在为5%～20%[22]，也可按照一定比例合用两种或两种以上的抗冻剂。总之，鱼类精子冷冻保存时，鲽形目使用DMSO作为抗冻剂较多[20,24,26]；鲶形目使用MeOH作为抗冻剂较多[16]；鲤形目使用DMSO[3,18]和EG[29]较多；鲈形目的鱼类没有特定的抗冻剂选择偏向，其他鱼类因数据较少，暂不能做出关于相关判断。此外，在配制保护液时可以加入添加剂，最常见的添加剂有二糖、维生素和蛋黄等。如在保存太平洋鳕(Gadus macrocephalus)[33]精子的保护液中添加了12%的丙二醇和10%的蛋黄。

3 冷冻程序

目前最常用的冷冻方法有程序降温法、二步法和三步法，也有不经降温直接冷冻的，冷冻方法一般遵循慢冻速融的原则，关键是寻找最佳降温速率。不同种鱼类精子适宜的降温速率（高度）有所不同，若精子在冷冻过程中胞内外水的进出达到平衡，则获得的冷冻效果最好。近年来，我国学者在多种鱼类中均找到了适宜的降温方法。其中二步法[8,12,16-18]是被应用最多的冷冻方法，其次是三步法[3,4,7,16,21,25,26]和程序降温法[5,33]。鲽形目[24,25]、鲱形目[3,4]、鲀科[7]大都用三步法冷冻精子，鲤形目[17]大都用二步法冷冻精子。

4 解冻方法

解冻可分为室温解冻和水浴解冻，目前常用的方法为水浴解冻。近年来我国学者探索了多种鱼类解冻的方法，例如：鲀吻黄盖鲽精子先从冷冻管中取出，平衡1 min 后迅速投入37 ℃水浴锅中摇晃解冻[25]；点带石斑鱼精子在液氮蒸汽中平衡10 min 后，直接放入40 ℃水浴至完全融解[21]；刀鲚精子在液氮口平衡5 min后，在37 ℃水浴中解冻[3]；兴国红鲤精子在37 ℃水浴条件下解冻100 s[8]；西伯利亚鲟精子在40 ℃水浴条件下解冻[9]；光唇鱼精子[17]和翘嘴鳜精子[16]在37 ℃条件下水浴解冻。

展望

鱼类精子超低温冷冻保存不仅有利于鱼类精子库和种质资源库的建立，而且可以为鱼类的遗传育种工作提供技术支持。但是目前为止，超低温冷冻保存鱼类精子依然存在许多技术瓶颈：一是由于鱼类种类较多，每种鱼类精子的最适保存条件各异，这加大了精子冻存的难度，也制约了超低温冷冻保存技术发展；二是配子质量评价系统不完善，对精子的质量评估无统一标准。

为了解决以上问题，今后可以从以下几个方面加大研究：一方面建立操作标准。可首先从每个科中筛选1种具有代表性的鱼类建立冷冻保存技术，此科中的其他鱼类可以参照该标准进行摸索，从而减少探索新物种精子冷冻保存的时间；另一方面参考人类的精子评估体系建立通用的配子质量评估体系。例如使用CASA (Computer-aided sperm analysis) 系统检测平均直线速度、平均曲线速度、平路径速度等。相信随着不同科中代表性鱼类精子超低温冷冻保存技术和精子检测技术标准的建立，鱼类精子超低温冷冻保存技术必将取得快速的发展。