超表达PpSnRK1不同亚基对番茄叶绿素荧光参数及光合特性的影响

陈晓璐,张淑辉,王文茹,于雯,罗静静,彭福田



超表达不同亚基对番茄叶绿素荧光参数及光合特性的影响

陈晓璐,张淑辉,王文茹,于雯,罗静静,彭福田*

山东农业大学 园艺科学与工程学院, 山东 泰安 271018

以超表达番茄株系（T41、T43、T44）、PpSnRK1β株系（T21、T23）、PpSnRK1β株系（T91、T92）及野生型番茄（）为试材，研究SnRK1对番茄叶绿素荧光参数及光合特性的影响。结果表明，植物的潜在最大光能转换效率（）比野生型高5.13%-7.70%；PSII的实际光化学量子效率（ΦPSII）比野生型高44.44%~94.44%。同时与野生型番茄相比，超表达各亚基的番茄功能叶片的净光合速率均有不同程度的提高，其中PpSnRK1β超表达株系比野生型WT提高38.76％和42.18%；CO2饱和点比野生型番茄均有不同程度的提高，比野生型高3.6%~30.73%。各转基因株系的胞间CO2浓度和气孔导度均高于野生型，并且随着中午气温的升高，野生型番茄胞间CO2浓度明显下降，而转基因株系没有显著的下降。因此，说明SnRK1对植物光合作用有重要的调控作用。

SnRK1; 番茄; 叶绿素荧光参数; 光合作用

（蔗糖非发酵–1–型相关蛋白激酶–1）与酵母中和哺乳动物中蔗糖非发酵相关的蛋白激酶在序列上高度保守[1]，在结构上，由一个催化亚基和与两个调节亚基组成三元复合体[2]，是植物体内生理活动的调控枢纽之一，在植物的矿物质摄取、非生物胁迫、逆境信号转导和生理代谢、ABA信号转导以及植物生长发育等各种激素代谢过程中发挥广泛的作用[3]，主要通过磷酸化修饰代谢酶活性的方式参与其中[4,5]。

光合作用是番茄生长发育和产量形成的基础，而番茄光合作用除受植株本身内在因素的制约外，还与CO2等各种环境因素密切相关[6]。CO2是空气中常见的化合物，也是植物进行光合作用的底物，目前空气中的CO2浓度(330 μmol·mol-1左右)远远低于植物的CO2饱和点，较低的CO2浓度就成为植物光合速率主要限制因子。近几年，大气中CO2浓度逐渐升高，CO2浓度升高会影响植物的生理反应，进而影响植物地上与地下部分的质量和生物量分配，以及土壤中根系和土壤生物的活动[7]。植物体内也相应地做调节，来应对这一外界环境的变化，例如，大气中CO2浓度升高在增强植物碳水化合物积累的同时，也需要植物形成一个更加强壮的根系以便吸收更多的养分，维持植物的正常生长，其中促进侧根的生长和发育是非常重要的方面。另外，大气CO2浓度升高在促进植物生长发育的同时，也会对植物的气孔密度、导度和运动带来明显的影响。之前关于对蛋白激酶相应机制的研究主要集中于碳氮代谢方面，这一方面的研究也越来越引起人们重视。

叶绿素被视为光合作用系统的内在探针，叶绿素荧光动力学过程研究是目前最为先进的无损伤测定植物光合作用能量吸收、传递、耗散、分配的的重要研究内容和方法。与“表观性”的气体交换指标相比，叶绿素荧光参数更具有反映“内在性”特点[8]。郭培国等[9]研究发现，增加铵态氮施用比例，烟草的和值升高，、Fv/F、比值有所上升，有利于改善光合特性，提高产量，改善品质。张其德等[10]对不同产量水平的水稻品种进行了苗期荧光动力学测定，结果表明，不同水稻品种苗期叶片的Fv/F和，均与该品种的产量水平呈正相关，其符合率高达93%。这说明几乎所有的光合作用过程的变化均可通过叶绿素荧光反映出来，是一种简便、可靠、快捷的方法。

通过本实验室前期对果树蛋白激酶的研究，发现平邑甜茬蛋白激酶亚基编码基因在番茄中超表达提高了植株的光合速率、淀粉含量及其利用率[11,12]，通过对数字基因表达谱的分析显示，光合途径中差异表达的10个基因中7个基因的转录水平被上调[13]。这些结果都表明，参与对植物光合途径的调控，但其机理尚不清楚。为进一步探究果树蛋白激酶的功能，本研究以超表达各亚基的番茄为试验材料，探讨1和2对番茄酶活性、叶绿素荧光参数、净光合速率、CO2饱和点等光合活性的影响，研究桃蛋白激酶各亚基对叶绿素荧光参数及光合特性的调节作用，为进一步阐明果树蛋白激酶的功能提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以野生型‘Sy12f’番茄（）和超表达1和2番茄植株为试材。

1.2 SnRK1酶活性测定

酶活性检测参照王贵芳等[13]的测定方法。

1.3 叶绿素荧光参数测定

使用FMS2叶绿素荧光仪（英国hansatech公司）于上午10点到12点测定在自然光下稳态荧光（F）、最大荧光值（F）和最大可变荧光（F），并于遮光暗处理20 min后测定暗适应的最小荧光（F）、最大荧光（F）和最大可变荧光（F）；由此得出暗适应和光适应下PSII最大光化学效率（和）、PSII的实际光化学量子效率（ΦPSII）和光化学淬灭系数（qP）。

1.4 净光合速率、CO2饱和点等光合活性指标测定

在8月份晴天选择充分展开的基部以上第四叶，采用CIRAS-3便携式光合仪（PP Systems，美国），CO2浓度设定为390 μL∙L-1，同时测定其净光合速率、胞间CO2浓度和气孔导度。测定不同番茄株系CO2饱和点时，CO2浓度由光合仪配套的CO2小钢瓶进行调节，测定时设定的内源光强为1100 μmol∙m-2∙s-1，每个CO2浓度下控制测定时间为300 s，数据稳定后记录，5次重复取平均值。

2 结果与分析

2.1 番茄株系SnRK1酶活

对超表达株系T41、T43、T44，1超表达株系T21、T23和2超表达株系T91、T92进行酶活性检测，结果显示其酶活性与对照野生型番茄WT相比都有所提高，分别增加6.82%、14.74%、18.31%，2.95%、9.54%和53.33%、36.47%（图1）。

图 1 野生型及转基因番茄株系叶片中SnRK1酶活性

注：WT：野生型；T41、T43和T44：超表达番茄株系；T21和T23：超表达1番茄株系；T91和T92：超表达2番茄株系。

Note: WT: wild type tomato; T41, T43 and T44: transgenictomato lines; T21 and T23: transgenic1tomato lines; T91 and T92: transgenic2tomato lines.

2.2 番茄株系叶绿素荧光参数

通过对野生型及各转基因株系进行叶片叶绿素荧光参数的测定，结果显示，与对照野生型番茄WT相比，除T41外，其他转基因番茄株系的F均高于野生型，其中T23和T91分别比野生型高10.79%和9.12%，差异显著。由表可以看出，转基因番茄株系叶片的和比野生型均有不同程度的提高，其中常用来表示光系统Ⅱ（PSII）的活性，结果显示，除1超表达株系T21、T23外，超表达株系T41、T43、T44和2超表达株系T91、T92较野生型相比均有明显提高，分别提高7.70 %、5.13 %、5.13%和7.70%、7.70%（表1）。

PSII的实际光化学量子效率（ΦPSII）反映了在照光条件下PSII反应中心部分关闭下的实际光化学的效率；可变荧光的光化学淬灭系数（qP）可以反映光合活性的高低。由表可以看出，转基因番茄株系叶片测定的ΦPSII均显著高于野生型，超表达株系T41、T43、T44，1超表达株系T21、T23和2超表达株系T91、T92分别比野生型高50.00%、61.11%、50.00%，44.44%、50.00%和94.44%、77.78％，其中PpSnRK1β超表达株系T91、T92最为显著；转基因番茄株系叶片测定的qP均高于野生型，其中PpSnRK1β超表达株系T92最为显著（表1）。

表 1 野生型及转基因番茄株系叶片叶绿素荧光参数

注：同列数字后不同字母表示不同转基因株系差异达5%显著水平。

Note: Values followed by different transgenic lines within a column are significant at the 5% level.

2.3 番茄株系净光合速率

通过对野生型及各转基因番茄株系进行净光合速率的测定，结果显示，超表达株系T41、T43、T44，1超表达株系T21、T23和2超表达株系T91、T92对比野生型番茄WT均有不同程度的提高，其中PpSnRK1β超表达株系最高，分别为20.4 μmol∙m-2∙s-1和20.9 μmol∙m-2∙s-1，比野生型WT提高38.76%和42.18%，差异显著（图2）。

图 2 野生型及转基因番茄株系叶片净光合速率

2.4 番茄株系二氧化碳饱和点

对野生型及各转基因株系进行CO2饱和点测定，结果显示，超表达株系T41、T43、T44，1超表达株系T21、T23和2超表达株系T91、T92对比野生型番茄WT均有不同程度的提高，其中2超表达株系最高，分别高出23.96%和30.73%，差异显著(图3)。

图 3 野生型及转基因番茄植株CO2饱和点

2.5 番茄株系胞间CO2浓度和气孔导度日变化

对野生型及各转基因番茄株系进行胞间CO2浓度及气孔导度日变化的测定，结果显示，各转基因株系的胞间CO2浓度均高于野生型，并且随着中午气温的升高，野生型番茄胞间CO2浓度明显下降，而转基因株系没有显著的下降（图4-A）；各转基因株系的气孔导度均高于野生型，在11:00时，气孔导度差异最为显著，超表达株系、1超表达株系和2超表达株系分别比野生型高12.33%、27.40%和31.51%（图4-B）。

图 4 野生型及转基因番茄株系胞间CO2浓度和气孔导度的变化

A：野生型及转基因番茄胞间CO2浓度的变化 Change of intercellular CO2 concentration in wild type and transgenic tomato leaves；B：野生型及转基因番茄株系气孔导度的变化 Change of stomatal conductance in wild type and transgenic tomato leaves

3 讨论与结论

叶绿素荧光动力学参数主要表达的是植物光合作用中的能量传递和转化[14]，几乎所有的光合作用过程的变化均可通过叶绿素荧光反映出来，而且其不仅能反映光合作用过程中的光能吸收、激发能传递和光化学反应等的光合作用原初反应过程，而且与其电子传递、质子梯度的建立及ATP合成和CO2固定等过程有关。Martin等[15]研究发现，高温破坏了PSII，使大麦PSII的电子供体和电子受体失活，光合放氧复合体的功能下降，大麦光合速率降低。前人另外研究发现，病害胁迫使得PSII开放的反应中心比例和参与CO2固定的电子减少，使光合电子传递能力减弱，光合色素捕获的光能以转化为化学能的速度和效率变慢，叶片暗反应受阻，PSII量子产量减小，光合速率下降，不利于棉花最终产量的形成[16]，这些都说明PSII反应中心是植物光合作用的重要部位。暗适应初始荧光（F），在一定程度上可以表示植物光合系统中PSII的抗损伤能力。本研究中，通过对叶绿素荧光动力学一系列参数进行测定，结果表明，除T41外，其他各转基因番茄株系F均高于野生型，一定程度上可以说明转基因番茄株系的光合系统中PSII的抗损伤能力有所提高。PSII有效光量子产量（）反映了开放PSII反应中心原初光能捕获能力[17]，而PSII实际光能量子产量（ΦPSII）则是反映反应中心在一部分关闭情况下的实际原初光能捕获系数[18]，光化学淬灭系数（qP）反映了PSII原初电子受体的开放程度，本研究结果表明，转各亚基番茄株系、ΦPSII和qP均高于野生型，其中超表达2番茄植株结果最为显著（表1）。这些结果都说明可以通过改善叶绿素荧光参数调控PSII反应中心进而调节植物的光合途径。

光合作用是番茄生长发育和产量形成的基础，拟南芥蛋白激酶的α催化亚基编码基因在叶肉细胞原生体中的瞬时表达发现，影响到超过1000个基因的表达，其中参与光合作用的基因表达被上调[19]，超表达马铃薯的净光合速率、蒸腾速率、胞间二氧化碳浓度和气孔导度均明显高于野生型马铃薯[20]，在本研究中发现转基因番茄植株功能叶净光合速率比野生型番茄均有不同程度的提高（图2），与前人研究相符，这说明可以参与植物光合途径的调控。到2100年，大气中CO2浓度将上升至540~970 μmol·mol-1之间[21]。CO2是植物光合作用的反应底物，因此，大气中CO2浓度升高造成温室效应的同时，也会影响植物的光合作用，同样会影响植物的生长。本研究对野生型及超表达番茄植株的CO2饱和点的测定表明，超表达各亚基番茄株系CO2饱和点均高于野生型，其中2在番茄中超表达提高最显著（图3），与前人研究相符。气孔是植物叶片与外界进行气体交换的主要通道。通过气孔扩散的气体有O2、CO2和水蒸汽。植物在光下进行光合作用，经由气孔吸收CO2。本研究对野生型及超表达番茄植株气孔导度及胞间CO2浓度的测定表明，与野生型番茄株系相比，转各番茄株系胞间CO2浓度和气孔导度受日气温影响变化幅度比野生型明显变小。Ryutaro Morita等[22]在水稻中研究发现，存在一个水稻营养器官淀粉合成过程中的正调控因子CRCT，超表达水稻的CO2饱和点提高，通过数字基因表达谱分析番茄中也存在CRCT同源基因可以被上调，初步推测可能通过调控此基因来调节CO2饱和点，但具体机理还需进一步研究。这都说明可能通过参与CO2吸收过程进而调节光合作用淀粉合成。

综上所述，在番茄中超表达提高了植株蛋白激酶的活性，改善了叶片中叶绿素荧光参数，提高了叶片的净光合速率和CO2饱和点，同时增加了植株的胞间CO2浓度和气孔导度；因此，可能通过改善叶绿素荧光参数及提高CO2吸收量等途径，调控植物光合作用途径。但是植物的光合作用是个复杂的过程，蛋白激酶参与光合作用的作用位点及其作用机理，还有待进一步研究发现。

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Effects of Different Subunits ofOverexpression on Chlorophy II Fluorescence Parameters and Photosynthetic Characteristics of Tomato

CHEN Xiao-lu, ZHANG Shu-hui, WANG Wen-ru, YU Wen, LUO Jing-jing, PENG Fu-tian*

271018,

Effects of SnRK1 on chlorophyll fluorescence parameters and photosynthetic characteristics of tomato were studied by overexpressing PpSnRK1 tomato lines (T41, T43, T44), PpSnRK1 1 lines (T21, T23), PpSnRK1 2 lines (T91, T92) and wild type tomato ().Results showed that the potential maximum light energy conversion efficiency (Fv/Fm) of plants is 5.13%-7.70% higher than that of wild type. PSII actual photochemical quantum efficiency (Φ PSII) is 44.44%-94.44% higher than that of wild type. The net photosynthetic rate of the functional leaves of tomato overexpression of PpSnRK1 subunits increased to some extent, the overexpression lines ofPpSnRK1βwere 38.76% and 42.18% higher than the wild-type WT. The CO2 saturation point of tomato was increased by 3.6% to 30.73% higher than that of wild-type tomato. The intercellular CO2concentration and stomatal conductance of all transgenic lines were all higher than those of wild type. With the increase of noon temperature, the concentration of intercellular CO2of wild type tomato decreased significantly, while that of transgenic lines did not decrease significantly, this indicated that SnRK1 plays an important role in regulating plant photosynthesis.

SnRK1; tomato; chlorophyll fluorescence parameters; photosynthesis

S641.2

A

1000-2324(2019)03-0361-06

10.3969/j.issn.1000-2324.2019.03.002

2018-02-27

2018-04-02

国家自然科学基金(31672099);山东省“双一流”建设奖补资金(SYL2017YSTD10);国家现代农业技术体系建设专项资金(CARS-31)

陈晓璐(1992-),女,硕士研究生,主要从事果树生理生态研究. E-mail:chenxiaolu1992@163.com

Author for correspondence. E-mail:pft@sdau.edu.cn