成骨细胞的功能与损伤和骨质疏松的防治*

刘扬捷 ，龚晓健 ，王永庆

1中国药科大学 药理学教研室，南京 210009；

2南京医科大学第一附属医院 临床药理研究室，南京 210029

骨质疏松（Osteoporosis，OP）是一种全身性骨骼疾病，其特征是骨量减少，骨结构塌陷，导致骨脆性增加，骨折风险增高。骨质疏松有两种形式：（1）原发性骨质疏松，包括青少年、男性、绝经后妇女和老年性骨质疏松；（2）继发性骨质疏松，由疾病和药物引起[1]。骨质疏松的诊断以骨密度（Bone mineral density，BMD）或骨矿含量（Bone mineral content，BMC）减少为基本依据。在所有骨质疏松诱发的骨折中，髋部骨折具有最高的发病率和致死率，多发于体弱的老年患者。对于绝经后女性，缺乏雌激素是骨量丢失的主要原因。维生素D的缺乏及继发性高甲状旁腺素水平可能与老年骨量丢失有关，特别是皮质骨。其它病理因素包括活动水平降低、血清胰岛素样生长因子下降等[2]。

成人的骨量通过破骨细胞的骨吸收和成骨细胞的骨形成作用来维持动态平衡[3]。破骨细胞来源于造血干细胞，通过血管进入骨表面并迁移到吸收位点，形成特殊膜结构域，称为封闭带。封闭带紧紧吸附于骨基质表面，将要吸收的区域封闭起来构成密闭环境。酸快速增强破骨细胞中碳水合酶（Carbonic anhydraseⅡ，CA Ⅱ）和空泡型H+-ATP酶（Vacuolar-type H+-ATPase）的表达，CAⅡ催化胞内H2O和CO2生成H+和HCO3-，H+通过V-ATPase转运至细胞外释放到吸收陷窝中，溶解结晶羟磷灰石。矿物溶解后，多种蛋白水解酶降解有机骨基质，MMP-9（Matrix metalloproteinases-9，明胶酶B）和组织蛋白酶K在破骨细胞中高表达，并向吸收陷窝中分泌，酶解富含胶原蛋白的骨基质，实现骨吸收作用[2]。

成骨细胞来源于骨髓间充质干细胞，在骨形成中起重要作用。骨形成可分几个阶段：首先前体成骨细胞增殖，随后分化为成熟成骨细胞，合成分泌胶原，胶原形成初始骨架结构，无机磷和钙离子结合发生矿化作用形成羟磷灰石，经过系列沉积和包埋，最终形成新的骨基质。骨形成结束后，成骨细胞有3种不同去向：（1）转变为骨细胞被包埋在骨基质中；（2）转变为骨衬细胞覆盖于骨基质表面；（3）经历程序性凋亡[2]。

治疗骨质疏松症的理想策略，是抑制破骨细胞的骨吸收或增加成骨细胞的骨形成功能。目前大多数针对骨质疏松症的治疗集中在抑制骨吸收，而对保护成骨细胞及增强其功能的关注相对较少，大多数骨质疏松疗法可有效减少骨丢失，但不能恢复丢失的骨量和骨强度[4]。因此，本文对成骨细胞各种损伤机制及相关功能蛋白作一综述，以期为更多针对增强成骨细胞骨形成功能的骨质疏松治疗策略提供新的思路。

1 成骨细胞功能蛋白

1.1 碱性磷酸酶（ALP）和骨钙素（OCN）

碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）是成骨细胞的典型蛋白产物，其活性能反映成骨细胞功能活性强弱。ALP属于早期成骨细胞增殖和基质成熟过程的标志蛋白，其功能是水解各种磷酸盐化合物（如ATP），释放无机磷酸（Pi）产物，Pi与细胞外基质钙沉积，发生结晶成核作用，介导羟基磷灰石的形成[4]。

骨钙素（Osteocalcin，OCN）是一种成骨细胞分化末期的标志蛋白，也被称为骨γ-羧谷氨酸（γ-carboxyglutamic acid，Gla）包含蛋白，属于非胶原酸性糖蛋白，是一种维生素K依赖性钙结合蛋白。OCN被分泌到细胞外基质中，Gla残基能与羟基磷灰石上的钙离子结合，引发羟磷灰石晶体形成，调节钙离子稳态和骨矿化[5]。但目前对OCN的功能存在争议。已有实验证明，不溶性的钙磷酸盐的沉淀会被Gla包含蛋白抑制[6]；骨钙素缺乏小鼠骨形成反而增加，且不影响骨吸收[7]。提示OCN是成骨细胞分化末期的标志物，但不能代表骨矿化程度，反而有可能抑制骨矿化作用。

1.2 骨唾液酸蛋白（BSP）和骨桥蛋白（OPN）

骨唾液酸蛋白（Bone sialoprotein，BSP）和骨桥蛋白（Osteopontin，OPN）均属于小整合素结合配体N-连接糖蛋白（Small Integrin Binding Ligand N-linked Glycoproteins，SIBLING）家族[8]。BSP出现于ALP表达之后，定位于矿化基质中，能促进体外羟磷灰石矿化成核作用，增加钙的掺入和结节形成。OPN又被称为分泌型磷蛋白-1（Secreted phosphoprotein 1，SPP1），是一种富含于骨基质中的非胶原糖蛋白，成骨细胞和破骨细胞均能分泌产生OPN。OPN对成熟破骨细胞的生成和骨吸收功能都有强大的刺激功能[4]。此外，由于OPN是一种被高水平酸性氨基酸磷酸化的蛋白质，其富含天冬氨酸的酸性结构域，能与细胞外基质的矿物质表面相互作用，从而发挥抑制骨矿化的作用[9]。Bouleftour W等[10]发现，BSP敲除小鼠的骨形成、骨吸收及骨矿化功能均受到损伤，而OPN表达量上调，OPN敲除小鼠的骨吸收功能被抑制。在BSP敲除的基础上让OPN基因也缺失，小鼠仍处于低矿化状态，但骨吸收活性很高，长骨标本显示皮质孔隙变大。并且双敲除小鼠骨转换和骨重塑被加强，提示双重缺失导致的表型，不能由单个基因敲除小鼠的特征预测，SIBLING蛋白之间的相互作用（而非单个蛋白的单一作用）在骨生物学调节中、特别是对基质矿化和骨强度上发挥更重要的作用。

1.3 Ⅰ型胶原（COLⅠ）

Ⅰ型胶原（Type 1 collagen，COLⅠ）是存在于大多数结缔组织中的纤维胶原蛋白，在骨骼、角膜、皮肤和肌腱中均含量丰富[11]。骨组织的独有特征之一，是在成骨细胞分泌的细胞外基质中出现磷酸钙沉积，即矿化作用。而在矿化之前成骨细胞首先分泌类骨质。类骨质主要包括Ⅰ型胶原、非胶原蛋白和蛋白聚糖。在成骨细胞、非胶原蛋白、各种离子、某些脂类及酶类的调节下，Ca2+和PO43-达到一定浓度时在Ⅰ型胶原纤维上沉积，形成羟基磷灰石。羟基磷灰石及其它少量矿物盐类（碳酸盐类、柠檬酸盐类）、类骨质、各种被包埋的细胞因子、酶类和水共同构成骨基质[2]。Ⅰ型胶原由三条多肽链以三股螺旋结构平行排列组装而成，这三种肽链的氨基酸序列包含Gly-X-Y重复结构，在组装中，Gly残基位于三螺旋中央，X-Y残基位于螺旋表面。在非螺旋羧端或氨基端上的赖氨酸或羟赖氨酸残基（称为端肽）与相邻胶原的螺旋部分之间发生交联。这个过程形成了Ⅰ型胶原初级结构中的羟甲基吡啶啉和赖氨酸吡啶啉交联。三条肽链其中之一富含脯氨酸和羟脯氨酸，羟脯氨酸在稳定三螺旋结构上起着重要作用，是胶原分子特征之一。Ⅰ型胶原以前肽形式分泌，在N端和C端都具有较大延伸肽，这些延伸蛋白在分泌和纤维形成过程中被特异性酶切除，形成较短的分子以备组装成原纤维[12]。

1.4 骨保护素（OPG）和核因子κB受体活化因子配体（RANKL）

核因子κB受体活化因子配体 （Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand，RANKL）广泛表达于骨髓间质细胞、成骨细胞和T细胞。它有两种受体，核因子κB受体活化因子（Receptor activator of NF-κB，RANK）和骨保护素（Osteoprotegerin，OPG）[4]。RANK 又称为破骨细胞分化激活受体（Osteoclast differentiation and activation receptor，ODAR），主要由巨噬细胞集落刺激因子（Macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）诱导表达于前体破骨细胞[13]。RANKL与RANK结合可诱导破骨细胞生成，破骨细胞的分化和骨吸收作用均被增强。OPG是成骨细胞分泌的一种RANKL的可溶性饵受体，可与RANK竞争性地结合RANKL，由此调控破骨细胞的增殖分化和骨吸收，进而调控骨代谢[14]。

1.5 Runt相关转录因子2（Runx2）和骨形态发生蛋白（BMPs）

成骨细胞的分化由多种转录因子调控，包括Runt相关转录因子 2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）、核心结合因子 α1（Core binding factor α1，Cbfa1）和 osterix（Osx）等[15]，其中Runx2在成骨细胞分化的多种信号通路中发挥了中心作用。Runx2可结合成骨基因启动子区的特异性顺式作用元件（Osteoblast-specific cis-acting element，OSE）2，增强ALP、OCN、BSP、COLⅠ等多种成骨功能性蛋白mRNA的表达。Runx2由丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）途径被磷酸化激活，而MAPK通路可通过细胞外基质中的Ⅰ型胶原与成骨细胞表面的β2β1整合素结合被激活，或利用成纤维细胞生长因子2（Fibroblast growth factor，FGF2）处理细胞激活通路。除MAPK通路外，Runx2活性还可通过刺激特定信号转导途径被增强，如PTH/PTHrP途径和BMPs途径。甲状旁腺素（Parathyroid hormone，PTH）与成骨细胞上的受体蛋白 （PTH receptor protein，PTHrP）结合后，通过PKA依赖性途径磷酸化Runx2，随后Runx2激活胶原酶3启动子[16]。

骨形态发生蛋白 （Bone morphogenetic protein，BMP）是一种能够单独诱导骨组织形成的局部生长因子，以BMP-2的功能最具代表性，在骨组织的修复过程中发挥重要作用。成熟的BMP蛋白结构是由二硫键连接的同型或异型二聚体，二聚体释放到细胞外后，与细胞膜上受体结合而发挥作用。BMP受体属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶跨膜受体，根据跨膜区下游是否存在特征性的SGSGS区（GS）盒，可分为Ⅰ型和Ⅱ型BMP受体，Ⅰ型存在GS盒，Ⅱ型则没有。只有当两个Ⅰ型和两个Ⅱ型受体形成异源二聚物时，才与配体具有高亲和力。BMP与异源二聚受体结合时，激活Smads蛋白复合体转导途径进而激活转录因子Runx2，而当BMP与同源Ⅰ型或Ⅱ型二聚受体结合时，激活MAPK通路[2]。

2 成骨细胞损伤（其机理路径见图1）

2.1 内质网应激（ERS）

内质网 （Endoplasmic reticulum，ER）是蛋白质合成、折叠、组装、运输、参与脂质代谢和储存Ca2+的重要场所。当细胞内外应激因素 （错误折叠或未折叠蛋白在ER腔内聚集、Ca2+稳态失衡、缺氧、异常糖基化、病毒感染等）使ER生理功能发生紊乱时，细胞会激活相关信号通路，引发内质网应激（Endoplasmic reticulum stress，ERS）， 以应对细胞病理条件和恢复ER内蛋白折叠环境。Park JK等[17]发现，ERS会抑制成骨细胞分化衣霉素（Tunicamycin，TM），通过刺激ERS从而抑制成骨细胞分化。TM诱导产生ERS后，小鼠的成骨细胞MC3T3-E1内活化转录因子3（Activating transcription factor-3，ATF3）表达上调，ATF3过表达会抑制BMP-2诱导的ALP及其它成骨标志蛋白的表达和激活。利用特异性短发夹RNA（Short hairpin RNA，shRNA）沉默 ATF3 可降低 TM 诱导的ALP表达减少，提示成骨细胞内发生ERS会引发ATF3表达上调，而ATF3是成骨细胞分化的负调节蛋白。

图1 成骨细胞损伤机理路径图

2.2 氧化应激（OS）

氧化应激（Oxidative stress，OS）是指体内氧化与抗氧化作用失衡，倾向于氧化，导致大量氧化中间产物的产生，是一种由自由基在体内产生的负面作用。已有研究表明，OS是骨质疏松症发生发展的主要因素之一[18，19]。在性类固醇缺乏、糖皮质激素过多和衰老因素引发的骨质疏松症中，OS均持续增加。OS的产生会抑制成骨细胞分化和增殖及诱导成骨细胞凋亡，因此，降低OS引起的成骨细胞凋亡，对于预防或减少骨质疏松症中的骨量丢失十分重要[20]。H2O2能诱导人成骨肉瘤细胞Saos-2和小鼠MC3T3-E1细胞均产生OS，使细胞内活性氧物质（Reactive oxygen species，ROS）生成增加，线粒体膜电位下降功能受损，细胞色素c由线粒体释放激活Caspase 3引发级联反应，使细胞凋亡增加；且ALP活性降低，OCN、Runx2 和 Osx 表达下调[20，21]。表明 OS 会使成骨细胞活力、活性及功能均受到严重损伤。

2.3 机械负荷过载损伤和糖皮质激素

机械负荷在骨量的调节中起着重要作用。然而，骨细胞并不总是处于生理压力之下。在某些情况下（如长期承重过度），骨组织长期处于过载机械环境，患者会出现骨痛、炎症及其它骨疲劳损害症状。过载损伤可能导致病理性的骨构塑与重建，累积的微损伤可能增加骨折风险。Liu Y等[22]利用四点弯曲装置将MC3T3-E1细胞暴露于机械拉伸应力下，建立过载损伤模型。过载损伤的成骨细胞增殖活力和矿化程度均受到抑制，COL I、ALP、OCN和Runx2基因表达下调，提示机械过载对成骨细胞的损伤作用在骨质疏松的发生、发展过程中可能也扮演了重要角色。

长期或过量使用糖皮质激素是继发性骨质疏松最常见的原因之一。糖皮质激素造成骨质疏松的原因包括抑制了小肠对钙、磷的吸收和肾小管对钙的重吸收，并能抑制破骨细胞的凋亡，延长其寿命，促进破骨细胞分化，最终破骨细胞的骨吸收作用增强。但更重要的原因是，糖皮质激素对成骨细胞的损伤。糖皮质激素可抑制骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化，增加成骨细胞凋亡，在糖皮质激素作用下OPG表达下降，而Rankl表达上调，Rankl对破骨细胞的激活作用增加[23]，骨吸收大于骨形成，引发骨质疏松症。

2.4 RNA影响

近年来，RNA对骨内分泌生理学和病理学的影响也受到关注。有学者发现，微小 RNA（MicroRNAs，miRNAs）和长非编码 RNA（Long non-codingRNAs，lncRNAs）对骨内分泌和构塑系统均发挥重要功能。Pan BL等[24]利用双侧卵巢切除制备大鼠OP模型，发现与对照组相比，OP组大鼠miRNA-182-5p表达显著增加，腺苷酸环化酶6（Adenylate cyclase 6，ADCY6） 和 Rap1/MAPK 通路中的信号蛋白（ERK1、ERK2、Rap1、P38 MAPK）基因表达则减少。OP大鼠给予阿仑膦酸钠后，可逆转OP大鼠miRNA-182-5p的表达上调和MAPK信号蛋白表达下调。miRNA-182-5p可特异性结合于ADCY6基因3'-UTR处，抑制ADCY6表达，由此抑制Rap1/MAPK信号通路的激活。利用MEK1/2抑制剂U0126抑制miRNA-182-5p可促进成骨细胞增殖分化，抑制细胞凋亡，提示miRNA-182-5p可促进成骨细胞凋亡，而ADCY6抑制成骨细胞凋亡，可为骨质疏松治疗提供新靶点。

lncRNA是一种核苷酸链长度超过200个碱基、且不能被翻译成蛋白的RNA分子，在很多方面与mRNA相似，因此又被称为mRNA样长链RNA，具有明显的组织和时空特异性。其功能包括抑制RNA聚合酶Ⅱ或介导染色质重塑和组蛋白修饰，影响下游基因表达；通过与mRNA形成互补双链，产生各种切割形式，干扰mRNA剪接等。抗分化非编码RNA（Anti-differentiation non-coding RNA，ANCR）对成骨细胞保持未分化状态十分重要，利用特异性siRNA沉默lncRNAANCR可增加成骨细胞ALP和OCN的表达。lncRNA-H19对成骨有加速作用，过表达lncRNA-H19在体外实验中能诱导成骨细胞分化。lncRNA-TSIX可通过下调miR-30a-5p加剧成骨细胞凋亡。这些lncRNA对骨代谢的调控机制可为骨质疏松症的调节和潜在治疗提供新思路[25]。

3 骨质疏松症的预防与治疗

对于骨质疏松的治疗，早期预防、早期发现与用药十分重要，治疗的关键是维持患者正常骨量和降低骨折发生率。骨质疏松的预防集中在运动和饮食，培养良好运动习惯可提高骨密度，降低老年人患骨质疏松的危险性。日常饮食中须保持摄入充足的钙（每天≥1 000 mg），为机体合成骨质提供原料。为保证钙的良好吸收，还应摄取足够的维生素D。鱼类、蘑菇和蛋类食品均富含维生素D，而牛奶及奶制品、燕麦片、海产品和鸡蛋黄等含钙较多，可适当食用，以保证钙的摄入[26]。骨质疏松症的治疗药物绝大多数为骨吸收抑制剂（雌激素、双膦酸盐、降钙素等），阿仑膦酸盐、利塞膦酸盐和唑来膦酸是目前被认为治疗骨质疏松的一线药物，可有效地降低老年患者脊柱、髋部和非脊椎部位骨折的风险。骨形成促进剂的种类较少，目前以甲状旁腺激素（Parathyroid hormone，PTH）及其类似物为主。特立帕肽是一种PTH类似物，作为一种合成代谢剂可刺激骨形成和骨吸收，可预防脊椎和非髋部骨折，但对降低髋部骨折风险疗效不明显。新型治疗药物还包括组织蛋白酶K抑制剂（如Odanacatib）和单克隆抗体类药物（如Romosozumab和Denosumab）。组织蛋白酶K是由破骨细胞分泌的胞外蛋白酶，可降解骨基质。Odanacatib选择性地抑制此酶，起到抑制骨吸收和增加骨密度的作用。Romosozumab通过抑制硬化蛋白发挥治疗作用。硬化蛋白可通过Wnt途径抑制BMPs对骨形成的诱导作用，Romosozumab特异性抑制此蛋白，可有效预防绝经后妇女椎体骨折；但有心血管严重不良反应，目前该药物仍未上市[27]。Denosumab是针对RANKL的重组人IgG单克隆抗体，其作用机制与OPG相似，通过特异性与RANKL结合，阻断RANKL对破骨细胞的激活作用，从而抑制骨吸收[28]。

此外，目前已有大量文献报道，多种天然产物和中药成分可通过不同途径对成骨细胞发挥保护作用，防止成骨细胞凋亡，增强其增殖分化以及骨形成功能。如Lee HY等[21]发现，猪胎盘水解产物可通过其抗氧化活性对抗H2O2诱导产生的OS和ERS，进而增强小鼠成骨细胞功能，上调ALP的表达[21]。类似抗氧化物质还包括姜黄素[20]、甘草素[29]、玉米紫色植株色素[30]等。生物硅或原硅酸产物可通过BMP-2/Smad/Runx2信号途径增强COLⅠ和OCN的生成，促进成骨细胞分化[31，32]。槲皮素可通过MAPK途径，促进大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化[33]。淫羊藿苷可通过Wnt/β-Catenin信号途径，对抗机械负荷过载对成骨细胞造成的损伤，受损细胞增殖分化及矿化作用均得到增强[22]。而乳糖益生元和益生菌之间的相互作用可通过以下途径来改善骨质疏松：（1）将不溶性无机盐转化为可溶性盐并增加肠壁对其的吸收；（2）维持并保护肠道内的矿物质吸收表面；（3）增加肠壁中钙结合蛋白的表达；（4）重塑破骨细胞和成骨细胞的生成；（5）释放骨调节细胞因子；（6）降解矿物质络合植酸[34]。

4 结语与展望

目前临床针对骨质疏松的治疗，成熟的治疗策略主要集中在抑制破骨细胞的骨吸收功能，以提高患者骨密度（BMD）。双磷酸盐是治疗骨质疏松症的一线用药，可有效对抗破骨细胞的骨吸收作用，在极高剂量下可直接增加破骨细胞凋亡，但其副作用也不容忽视，包括体重减轻、坐骨神经痛、皮疹和哮喘等[24]。此外，有文献报道指出，长期服用双磷酸盐类药物会引起骨微损伤的持续累积，导致骨小梁结构丧失完整性、骨抗张力强度下降，最终降低骨组织机械强度[35]。而质子泵抑制剂（Proton pump inhibitor，PPI）是抑制胃酸分泌的一线用药，已有大量文献证实，长期服用PPI会增加患者骨质疏松及骨折风险[36，37]。有文献报道称，PPI作为针对胃壁细胞H+/K+-ATPase的抑制剂，也可抑制破骨细胞表面V型H+-ATPase活性，使其泌酸能力下降，由此导致破骨细胞骨吸收功能被抑制[38]；但显然PPI对破骨细胞功能的抑制并不能降低其对患者骨质疏松及骨折风险的影响。

综上所述，与抑制骨吸收相比，增加成骨细胞的骨形成以恢复丢失的骨量和骨强度，是治疗骨质疏松更加安全有效的措施，而深入了解成骨细胞功能、损伤机制及相关蛋白与信号通路是建立有效治疗策略的基础。随着对成骨细胞研究的深入，临床将会出现更多安全有效的药物用于保护和提高成骨细胞功能，以预防和治疗骨质疏松。