补肾活血方对宫腔粘连子宫内膜ER、PR表达的影响*

刘碧星 赖玉华 罗颂平 陈 鹏 陈忠生

由于各种原因引起子宫内膜基底层受损，进而导致子宫壁相互粘连的病理现象称为宫腔粘连。宫腔粘连对育龄期妇女生育能力危害极大，临床主要表现有月经量少或闭经，不孕及习惯性流产。普通人群中宫腔粘连发生率为1.5%[1]，而不孕症患者中发生率高达13%[2]。宫腔镜下粘连分离术已被证实为一种安全有效的治疗方法，但仍存在较高的复发率。宫腔粘连分离术后再粘连的预防是生殖医学界的难题，也是研究的热点。 有文献显示中医补肾活血方可减少宫腔粘连术后复发的几率，但是其原理尚未明确。笔者通过补肾活血方联合雌孕激素用于宫腔粘连电切术后，研究宫腔粘连患者术前、术后雌孕激素受体及细胞增殖蛋白 Ki67的表达，拟了解补肾活血方的作用机理，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料本研究选择妇科住院部符合纳入标准的宫腔粘连患者22例，术前均对其进行中国宫腔粘连诊断分级评分，测定增殖期内膜厚度，所有患者均行宫腔镜下粘连电切术+上环术，并在术中钳取少许内膜组织测定ER、PR、Ki67，术后给予雌孕激素序贯治疗3个月。22例患者按随机数字表法分为治疗组10例及对照组12例。2组年龄、孕产次、人流清宫次数、术前增殖期内膜厚度、术前评分等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 诊断标准有宫腔操作手术史、月经过少或闭经，宫腔镜下诊断为宫腔粘连者[3]。

1.3 纳入标准1)宫腔镜下诊断为宫腔粘连，拟行宫腔粘连电切术的患者诊断分级标准参考2015年中华医学会妇产科分会《宫腔粘连临床诊疗专家共识》[3]。2)根据最新的中国宫腔粘连诊断分级评分≥9分，评分标准见表1。3)年龄20～40岁。

表1 宫腔粘连评分标准

注：轻度：总分0～8分；中度：总分9～18分；重度：总分19～28分

1.4 方法

1.4.1 治疗方法本研究采用前瞻性试验性设计方案，遵循随机对照的原则进行。对所有纳入研究的患者进行术前评分及测定增殖期子宫内膜厚度，并行宫腔镜下粘连电切术+上环术，术中取少许内膜组织测定ER、PR、Ki67的表达,术后进行3个月的药物治疗，药物治疗后在月经干净2～7 d再次行宫腔镜检查并取环，再次评分及测定增殖期内膜厚度，并取少许内膜组织再次测定其ER、PR、Ki67的表达水平。治疗组10例:给予补肾活血方+雌孕激素序贯治疗。补肾活血方在非月经期口服，每日2次，连续3个周期。戊酸雌二醇2 mg每日2次×21 d(月经第5天开始服)+地屈孕酮10 mg每日2次×10 d(月经第16天开始服)，连续3个周期。对照组12例：给予雌孕激素序贯治疗。戊酸雌二醇2 mg每日2次×21 d(月经第5天开始服)+地屈孕酮10 mg每日2次×10 d(月经第16天开始服)，连续3个周期。其中补肾活血方组成：菟丝子20 g，枸杞子15 g，覆盆子15 g，车前子(包煎)10 g，茺蔚子15 g，当归10 g，赤芍10 g，熟地黄10 g，三七10 g，丹参10 g，香附10 g，淫羊藿10 g。戊酸雌二醇片1 mg×1盒,辉瑞制药; 地屈孕酮片10 mg×1盒,雅培制药。

1.4.2 观察指标增殖期子宫内膜厚度、宫腔粘连评分、ER、PR、Ki67。

1.4.3 标本采集及结果判断标准标本采集：手术时机选择在月经干净后2～7 d，闭经者手术时间不受限制。研究员于术中取适量粘连组织旁的子宫内膜组织，对于无明显子宫内膜组织的重度患者取适量粘连组织。取出宫腔组织用福尔马林固定，石蜡包埋，切片厚3～4 μm，置(60±5)℃的烤箱中烤干(约2 h)。 免疫组织化学检测：雌孕激素受体检测试剂盒(Dako，即用型)，克隆号为EP1及PgR636；兔抗多克隆抗体Ki67 Ab(NovocastraTM，即用型)，克隆号为MIB-1；PBS缓冲液(pH 7.4)、 0.01M柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)、EDTA抗原修复液(pH 8.0)、3%H2O2阻断内源性过氧化物酶以上溶液由中杉金桥公司提供，并按其说明书配制使用。检测系统：Dako EnVisionTM检测系统。显色剂：Dako REALTM DAB显色剂。对标本预处理后进行脱蜡及抗原修复，按顺序取出切片，擦干组织周围的水，用免疫组化笔在组织块周围(离组织边缘3 mm左右)画一圆圈，放回蒸馏水中；相同方法依次对所有组织切片画圈；移入PBS缓冲液冲洗3 min×3次；按顺序取出待测组织切片，甩去玻片上多余的PBS，滴加相应抗体，放入孵育盒内；抗体的量以充分覆盖组织块为度，阴性对照片上滴加PBS缓冲液；切片加完抗体后，盖上孵育盒盖子，37℃孵育50 min；滴加PBS缓冲液冲洗，冲洗3 min×3次；将所有组织切片按顺序逐一滴加二抗(Dako EnVisionTM检测系统)，抗体的量以充分覆盖组织块为度，孵育盒中室温孵育30 min；滴加PBS缓冲液冲洗，冲洗3 min×3次；显色、复染、封片，取20 μl DAB原液和1 ml底物缓冲液混合均匀，一般使用前1 h内配制，按顺序逐一取出组织切片，甩干组织周围的多余的PBS，滴加已配好的DAB显色液显色2～5 min，同时在显微镜下观察，根据染色强弱及背景颜色适时终止显色。判断标准：研究者在显微镜(400×)下观察切片，根据阳性细胞所占比例及阳性细胞染色强度判定，在每个切片中选择5个高倍镜视野。 ER、PR结果判定标准：强阳性(+++，棕黄色细胞≥60%或深褐色细≥30%)，中度阳性(++，浅黄色细胞≥50%或20%≤棕黄色细胞，弱阳性(+，浅黄色细胞<50%或棕黄色细胞<20%)，阴性(-，无染色)。 Ki67结果判定标准： 阳性细胞数0～5%为(-)，6%～25%为(+)， 26%～50%为(++)，≥51%为(+++)。强阳性为4分，中度阳性为3分，弱阳性为2分，阴性为1分。

1.5 统计学方法全部数据采用χ2检验、t检验或Fishers Exact Test Pearson 相关分析检验，P<0.05 为差异有统计学意义，分析采用SPSS 10.0 统计软件进行。

2 结果

2.1 2照患者组年龄、孕产次、人流清宫次数2组间年龄、孕次、产次和人流清宫次数均无统计学差异(P<0.05)。见表2。

表2 2组患者临床资料比较 (例，

2.2 2组患者治疗前后ER、PR、ki67表达评分比较2组间ER、PR、K-67表达治疗前差异不显著(P>0.05)，治疗后两组上述各指标均较治疗前显著上升(P<0.05)。除Ki67外，治疗后治疗组ER、PR评分均显著高于对照组(P<0.05)。见表3。

2.3 2组患者治疗前后内膜厚度、评分比较2组治疗后内膜厚度均较治疗前显著上升(P<0.05)，评分显著下降(P<0.05)，且治疗组上述情况显著优于对照组(P<0.05)。见表4。

表3 2组患者治疗前后ER、PR、Ki67表达评分比较 (例，

注：与治疗前比较(治疗组：tER=2.741，P=0.013；tPR=2.685，P=0.015；tKi67=2.173，P=0.043；对照组：tER=2.137，P=0.044；tPR=3.130，P=0.005；tKi67=3.298，P=0.003),1)P<0.05；与对照组比较(tER=2.596，P=0.017；tPR=2.099，P=0.049)，2)P<0.05

表4 2组患者治疗前后内膜厚度、评分比较 (例，

注：与治疗前比较(治疗组：t内膜厚度=3.327，P=0.004；t评分=6.870，P=0.000；对照组：t内膜厚度=3.426，P=0.002；t评分=7.179，P=0.000)，1)P<0.05；与对照组比较(t内膜厚度=2.265，P=0.035；t评分=2.171，P=0.042)，2)P<0.05

3 讨论

宫腔粘连严重危害女性的生育力，并且治疗后存在较高的复发率，其中重度粘连术后复发率可高达62.5%[4]。预防宫腔粘连术后复发目前是医学难题，其中治疗方法也在不断推陈出新，而各家有各家的治法和经验。总体上来说目前治疗方法有以下3个方面：1)通过放置宫内节育器、宫腔球囊、防粘剂及防粘连膜等直接阻碍子宫内膜前后壁创面的接触；2)通过用雌孕激素周期模仿正常人的激素改变来刺激残余的子宫内膜生长并使术后创面重新上皮化；3)通过羊膜移植、子宫内膜干细胞移植等方法，然而这些方法尚在研究阶段，没有在临床上广泛应用。通过物理屏障防止宫腔粘连只是权宜之计，当物理屏障去除，粘连可能再次发生。而在临床工作中我们发现大剂量的雌激素也并不能达到理想的效果，经过激素治疗患者的月经量并没有增加，内膜没有增厚，生育问题依旧无法解决。 笔者假设大剂量雌孕激素无法起效的原因可能是宫腔粘连内膜损伤后导致雌孕激素受体表达下降，雌孕激素无法与足够的受体结合，进而无法达到相应的生物效应。

张娟等[5]应用免疫组化SP法检测30例子宫内膜各层中ER、PR的表达，结果提示功能层、基底层和浅肌层中ER和PR蛋白表达水平是依次降低的，由此可能提示子宫内膜不同损伤部位的 ER和 PR表达并不一致。杜艳芳等[6]检测宫腔粘连组(实验组)和非宫腔粘连组(对照组)子宫内膜组织中ER、PR和NF-кB的表达水平，结果显示非宫腔粘连组子宫内膜中 ER和PR的表达均高于宫腔粘连组，在轻度粘连组的表达高于重度粘连组(P<0.05)。ER在轻度粘连组中的表达也高于中度粘连组(P<0.05)。由于ER和 PR主要在子宫内膜上皮细胞和间质细胞中有表达，一旦破坏了子宫内膜基底层，残留的子宫内膜减少，ER和 PR的表达就相应降低，而雌孕激素对靶细胞的效应强弱与靶细胞中雌孕激素受体水平高低密切相关， ER和 PR的表达下降直接影响子宫内膜在雌孕激素作用下的增生和修复，从而影响宫腔粘连的治疗效果。而Ki67是一种细胞增殖性抗原，维持细胞循环的新蛋白，被认为是细胞增殖的一个重要标志[7]。目前关于Ki67的研究主要集中在肿瘤学方面。宫腔粘连患者内膜功能层受损，内膜菲薄，是否与细胞增殖障碍有关呢？ 因此笔者在研究中将Ki67的表达加入本次研究的范畴。

本研究结果显示治疗前2组间ER、PR、Ki67表达差异不显著(P>0.05)，治疗后2组上述各指标均较治疗前显著上升(P<0.05)。除Ki67外，治疗后治疗组ER、PR评分均显著高于对照组(P<0.05)。2组治疗后内膜厚度均较治疗前显著上升(P<0.05)，评分显著下降(P<0.05)，且治疗组上述情况显著优于对照组(P<0.05)。研究结果显示补肾活血方及雌孕激素能均能提高雌孕激素受体及细胞增殖蛋白Ki67的表达，且加用补肾活血方比单用雌孕激素对提高雌孕激素受体的表达、增加术后增殖期内膜厚度及降低宫腔粘连评分的效果更优，而2组治疗后细胞增殖蛋白Ki67的表达没有明显差异。

中医古籍中并无“宫腔粘连”的记载，然宫腔粘连病位在胞宫，多是手术时胞宫、胞脉受损，肾精受损，冲任气血不足,精血俱损，瘀血邪毒内蕴，胞脉闭塞所致，结合其月经过少、闭经的临床表现，究其病因病机,多责之于肾虚血瘀。《证治准绳·女科·调经门》指出：“经水涩少,为虚为涩,虚则补之,涩则濡之。”故补肾活血为本病的治疗大法。本病病机虚实错杂，既不可妄行攻破，以免重伤精血，又不可一味填补，使瘀血不去，新血难生。本研究中补肾活血方由菟丝子、枸杞子、覆盆子、车前子、茺蔚子、当归、赤芍、熟地黄、三七、丹参、香附、淫羊藿组成，该方以菟丝子和枸杞子为君药，补肝肾之阴，覆盆子、熟地黄滋精生血为臣药，淫羊藿温补肾阳，助阴长，车前子微寒轻泻肾中虚火为佐药，茺蔚子入血分，善活血行气，祛瘀通径，香附行气解郁，疏肝通经，当归、赤芍、三七、丹参活血化瘀，助气血运行，全方补中有通，攻补兼施，使精气盛，冲任充，瘀血去，新血生，血海自能满溢。学者们对补肾活血中药的机理也从现代医学的角度进行了相关的研究。陈媛媛等[8]的研究认为补肾中药具有类雌激素样作用，能调整肾-天癸-冲任-胞宫轴，改善盆腔内环境，促进子宫内膜腺体和间质的增殖与修复，从而促进子宫内膜雌孕激素受体的表达，以达到治疗宫腔粘连的目的。贾金英等[9]认为活血化瘀药物可以促进微循环功能,改善宫腔内组织缺血状态,促进吞噬细胞的吞噬功能；能将纤维蛋白清除使间质细胞再生修复,从而促进局部瘀血的吸收，结缔组织松解而达到生理性恢复粘连的目的。

综上所述，补肾活血方联合雌孕激素可有效预防宫腔粘连电切术后再粘连的发生，改善宫腔环境，增加内膜厚度，其作用机制可能通过提高雌孕激素受体的表达来完成。但该研究样本量较少，需要更多的样本支持及动物实验研究来进一步证明。