鞘内注射舒芬太尼对慢性神经痛大鼠脊髓背角NMDA受体表达的影响

2019-06-27 05:42郑孝振韩箫笛宋俊杰毛姗姗白明松洪道先
中国合理用药探索 2019年5期
关键词:造模脊髓芬太尼

郑孝振,韩箫笛,宋俊杰,毛姗姗,白明松,洪道先

(河南大学第一附属医院麻醉科,河南 郑州 475000)

N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid,NMDA)为细胞内的重要信号转导分子,细胞中分布广泛,生物学功能复杂。当外周神经发生损伤后,脊神经纤维会释放出大量的降钙素基因相关肽和兴奋性氨基酸[1-2],通过激活脊髓背角神经元的突触后膜,产生快速的突触电位,从而解除NMDA受体上的压力,激活NMDA受体,开放钙离子,进一步增加NMDA受体的数量,增强突触后神经元的兴奋性。有研究报告表明,舒芬太尼可有效缓解神经病理性疼痛程度[3-4]。本研究旨在评价鞘内注射舒芬太尼对神经性痛大鼠脊髓背角内NMDA受体表达的影响,为舒芬太尼在慢性神经痛中的应用途径、剂量以及效果提供参考依据[5]。

1 材料和方法

1.1 实验动物

选取健康清洁级成年雄性SD大鼠,购自上海生工动物实验中心,体质量200~250 g,自由进食,温度22℃~25℃,湿度55%左右,昼夜比1︰1,适应环境1周后进行实验分组。随机选择5只作为空白对照组,其余大鼠制备慢性坐骨神经损伤模型,造模成功后随机分为模型组和观察组,各15只。

1.2 制备慢性神经痛模型

大鼠经腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉,侧卧位固定,距股骨下1 cm沿股骨走形切开皮肤,钝性分离充分显露右侧坐骨神经和周围组织,游离主干分叉以前约8 mm,含铬羊肠线在神经起始点2 mm处将坐骨神经结扎4道,每道相隔1 mm,局部生理盐水冲洗,间断缝合皮下组织。以大鼠出现缩足、舔尾等行为,疼痛阳性反应为建模成功。

1.3 实验方法

观察组鞘内注射舒芬太尼1 μg+氯化钠注射液稀释至10 μL,模型组注射等量0.9%氯化钠注射液;分别于造模后即刻、3 d和5 d评价运动功能,热缩足反射潜伏期法(TWL)检测疼痛阈值,免疫组化染色法检测脊髓背角NMDA受体阳性表达。

1.4 鞘内注射

建模后2 h大鼠吸入异氟烷麻醉,俯卧位固定,选取L3~L4间隙为切口位置,纵形切口长度3 cm,钝性分离肌肉组织,显露L3~L4脊突间隙;利用25 G针穿刺黄韧带和硬脊膜,待脑脊液流出视为穿刺成功。将导管经硬脊膜口缓慢插入8 cm,开口端固定于L1~L2,另一端经皮下隧道在颈背部引出,外露2 cm将导管口夹闭并固定。待大鼠麻醉失效后,微量注射10 μL舒芬太尼或0.9%氯化钠注射液,以10 s内双肢出现无法负重、无逃避反应且20 min可恢复为注射成功。

1.5 检测指标与方法

1.5.1 运动功能评分:0分为运动功能无改变,可以正常行走;1分为运动轻度受限,足底刺激可出现正常缩爪反应;2分为自主运动能力减低,中度运动受限;3分为自主活动完全受限,无法行走。

1.5.2 疼痛阈值检测:把大鼠放在有机玻璃箱中,置于玻璃板上,适应30 min后,采用红外线光束照射大鼠术侧足底中部,至大鼠表现逃避性行为终止,热刺激基础强度设定10 s,自动切断时间设定20 s,每只大鼠测量5次,间隔时间5 min,取平均值。

1.5.3 免疫组化染色法:常规制作脊髓背角组织切片,厚度5 μm,经脱蜡、水化,抗原修复和封闭后;滴加兔抗鼠NMDA受体单克隆抗体一抗(江苏碧云天科技有限公司,工作浓度1︰2000),置于湿盒内4℃孵育过夜,磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤;滴加羊抗兔IgG多克隆抗体二抗(江苏碧云天科技有限公司,工作浓度1︰500),置于湿盒中27℃孵育20 min;滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液(江苏碧云天科技有限公司),置于湿盒中27℃孵育20 min,PBS振荡洗涤5 min×3次;DAB显色、复染、透明、中性树胶封片、光学显微镜下观察。结果判定:采用半定量法,依据染色强度和染色细胞所占比率;以胞浆或胞核黄染至深棕色为阳性,染色强度中无阳性染色为0分,弱染色为1分,中等强度染色为2分,强染色为3分;阳性细胞数比率≤5%为0分,6%~25%为1分,26%~50%为2分,51%~75%为3分,>75%为4分;两项乘积0~3分为阴性,4~12分为阳性。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 运动功能评分的比较

造模后即刻模型组和观察组大鼠的运动功能评分高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);观察组3 d和5 d运动功能评分逐渐下降,显著低于造模后即刻,差异有统计学意义(P<0.05);模型组不同时间变化差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 运动功能评分比较

2.2 疼痛阈值比较

造模后即刻模型组和观察组大鼠的疼痛阈值较对照组降低,差异有统计学意义(P<0.05);观察组3 d和5 d的疼痛阈值较造模后即刻逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05);模型组不同时间差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 疼痛阈值的比较

2.3 脊髓背角NMDA受体阳性表达比较

造模后即刻模型组和观察组大鼠脊髓背角NMDA受体阳性表达高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);观察组3 d和5 d阳性表达较造模后即刻逐渐降低,差异有统计学意义(P<0.05);模型组不同时间差异无统计学意义(P>0.05)。见表3

表3 脊髓背角NMDA受体阳性表达比较

3 讨论

本实验采用大鼠作为研究对象,大鼠选择性神经损伤模型(SNI)引起的神经损伤程度稳定,且重复性好,诱发行为表现更加持久,损伤传入神经元,能够模拟临床上神经病理性疼痛的特征,是一种较为稳定的大鼠模型。本研究探讨舒芬太尼减轻神经病理性疼痛的机制,选择术后各个时间点进行观察,结果发现,造模后即刻模型组和观察组大鼠的疼痛阈值较对照组明显降低;观察组3 d和5 d的疼痛阈值较造模后即刻显著升高,差异显著;模型组不同时间点的疼痛阈值比较差异无统计学意义。说明鞘内注射舒芬太尼对神经性痛大鼠的痛觉有显著改善作用,可减轻神经疼痛。造模后即刻模型组和观察组大鼠的运动功能评分显著高于对照组;观察组3 d和5 d运动功能评分逐渐下降,显著低于造模后即刻;模型组不同时间点的运动功能评分比较差异无统计学意义。说明舒芬太尼可以在减轻大鼠神经痛的同时,恢复大鼠的运动功能。造模后即刻模型组和观察组大鼠脊髓背角NMDA受体阳性表达显著高于对照组;观察组3 d和5 d阳性表达较造模后即刻逐渐降低,差异显著。说明建模后大鼠脊髓背角NMDA受体量及阳性表达量增加,使用舒芬太尼后可降低大鼠脊髓背角NMDA的阳性表达,可能是通过抑制降钙素基因相关肽(CGRP)激活和NMDA释放有关。大鼠发生神经痛后,导致CGRP表达和脊髓背角神经元NMDA受体上调,提示这两种受体均参与了神经病理性疼痛的维持和形成。舒芬太尼可通过下调这两种受体的表达,来减轻疼痛感,但具体作用机制需要进一步研究讨论。

综上所述,鞘内注射舒芬太尼可减少神经痛大鼠脊髓背角NMDA受体的表达,减轻疼痛感,增强运动能力。该研究的创新点在于为舒芬太尼在慢性神经痛中的应用途径以及效果提供参考依据,但是未能深入分析舒芬太尼对NMDA受体不同亚型的表达水平及作用效应,观察时间有限,舒芬太尼对慢性神经痛的远期干预效果还需要进一步验证。

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