三磷酸腺苷在新生大鼠耳蜗血管纹缘细胞中的释放机制

刘斌 李吉平 刘君

上海交通大学医学院附属仁济医院耳鼻咽喉科（上海200120）

哺乳动物的耳蜗是一个结构复杂精细、排列高度有序的听觉感受器官。耳蜗外侧壁的血管纹是维持内耳内环境稳定非常重要的结构，血管纹的缘细胞对于维持耳蜗内淋巴液中高浓度的K+积聚及内外淋巴液中K+的循环有着重要意义[1]。在耳蜗中，三磷酸腺苷(ATP)是对调节声转导、听敏度、外毛细胞主动的机械放大、耳蜗内电位、耳蜗内环境稳定、控制血管张力等具有关键作用的信号分子[2]。目前的研究认为耳蜗中ATP的主要来源有三种：①血管纹的缘细胞；②未成熟的耳蜗大上皮嵴的支持细胞；③成熟耳蜗的支持细胞[3,4]。陈洁等[5]发现ATP以囊泡的形式储存于新生大鼠耳蜗血管纹缘细胞中，并且可向胞外释放ATP。在我们之前的实验中[6]，进一步证实了ATP以囊泡的形式储存在缘细胞的溶酶体中，ATP释放的量可以被钙离子依赖的拮抗剂所抑制，在单独加入溶酶体膜裂解剂，即溶酶体肽链端解酶组织蛋白C(glycyl-L-phenylalanine-3-naphthylamide，GPN)或内质网钙库耗竭剂-毒胡萝卜素（TG）后，细胞外液中ATP的含量增加，而GPN不能使TG处理过的细胞外液中ATP含量增加，提示缘细胞胞外ATP释放与内质网的钙库之间存在相互作用，但是未能阐明具体机制。有研究发现P2嘌呤受体广泛表达于内耳组织中，P2Y受体主要分布于内外毛细胞、支持细胞和血管纹组织内[7]。同时，1，4，5-三磷酸肌醇（IP3）受体在大鼠耳蜗血管纹中均发现有表达[8]。在人类间充质干细胞和分离的胰岛细胞中发现，在细胞外液无钙离子的环境中，ATP可以通过P2YR-PLC-IP3触发钙波的释放[9,10]。国内外近期研究发现，在星形胶质细胞中，ATP通过溶酶体胞吐作用释放至细胞膜外，从而发挥生物学作用，单核细胞通过钙依赖性的P2YR-PLC-IP3嘌呤信号系统触发溶酶体胞吐作用释放ATP[11,12]。在单核细胞中加入TG，内质网释放的钙离子可以触发溶酶体胞吐作用，引起细胞外液中ATP释放量增加[12]。在原代培养的缘细胞中，我们[6]发现当加入GPN后，标记溶酶体胞吐作用的染料FM1-43荧光强度增强，同时伴ATP浓度增高，未能阐述钙离子与ATP释放机制之间的关系。ATP通过作用于P2嘌呤受体参与调节耳蜗听觉生理功能，因此研究ATP在血管纹缘细胞中的释放和作用机制有重要意义。本研究将着重阐述新生大鼠耳蜗血管纹缘细胞中ATP与钙依赖性的嘌呤信号系统及溶酶体胞吐机制之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

SD新生大鼠购自中科院上海实验动物中心，研究方案得到上海交通大学医学院附属仁济医院伦理委员会的批准。钙离子荧光探针Fluo-4AM（货号S1060）、溶酶体荧光探针(货号C1046)均购自江苏碧云天生物有限公司。β-氨基己糖苷酶底物（货号N9376）购自sigma公司。CellTiter-G10TM（货号G7571）试剂盒购自promega公司。

1.2 原代细胞培养、纯化

采用出生1天的SD大鼠，在冰浴无菌DPBS溶液中打开尚未骨化的听泡壁，完整剥开蜗壳后暴露蜗轴，从底回至顶回撕下整个膜迷路，分离血管纹。具体方案按照我们既往的实验研究[6]。

1.3 钙成像

取出培养的细胞，除去培养基，使用不含钙离子的HBSS溶液洗涤细胞3次。先加入0.1μM lysotracker，37°C细胞培养箱孵育30分钟，溶液量以覆盖细胞为准。再加入2.5μM Fluo 4-AM工作液，与Lysotracker在37°C细胞培养箱共同孵育30分钟。除去Fluo 4-AM工作液，用HBSS溶液洗涤细胞3次，以充分去除残留的Fluo 4-AM和Lysotracker工作液。然后加入HBSS溶液覆盖细胞。37°C培养箱孵育约20-30分钟。在激光共聚焦显微镜下观察并摄影，做荧光染色分析。

1.4 生物发光法测定ATP浓度

采用CellTiter-G10TM试剂盒，将ATP标准物（Sigma-Aldrich,A6559,USA）10倍稀释，用酶标仪（SpectraMax M2e,Molecular Devices,USA））的LUM模式测定不同ATP浓度时的生物发光强度，将1×104细胞接种于96板中过夜，每孔100μl培养液，同时准备对照孔，只加培养液，不含细胞；每孔中加入与培养液等体积的混合反应液；在混匀器中混匀2 min；将96孔板放置于室温中10 min，以获取稳定的荧光信号；检测发光强度。再根据标准曲线算出不同处理组中的ATP浓度。实验重复3次，每次设立3个复孔。

1.5 β-氨基己糖苷酶释放率测定

1×104缘细胞接种于24孔细胞培养板中，吸去培养液并以孵育缓冲液淋洗3遍，每孔加入100μl孵育缓冲液37℃预孵育10min。分别加入不同浓度受试液100μl或等量的阴性对照（缓冲液），37℃孵育5 min，孵育结束后冰浴10min终止反应，取各孔上清液100μl转入96孔培养板中，同时加入100μl底物（p-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide(4 mmol/L)，37℃孵育60min，最后加入200μl终止液（200 mmol/L）甘氨酸缓冲液(pH 10.7)）终止反应，测定405nm各孔反应液吸光度。移去24孔板中各孔剩余上清液，然后每孔加入200μl Triton X-100（0.5%）裂解细胞，裂解液3000rpm×1min离心，取上清100μl转入96孔培养板中，同上操作测定细胞裂解液中β-氨基己糖苷酶含量。根据公式计算不同处理组β-氨基己糖苷酶释放量。β-氨基己糖苷酶释放量（%）=[上清液吸光度/（上清液吸光度＋细胞裂解液吸光度）]×100%。每次独立实验重复三次。

1.6 统计学方法

本研究中的数据分析采用的是SPSS 26.0 software(IBM SPSS Inc.)，图像处理所用软件为Graph-Pad Prism v5.0(GraphPad Software,Inc.);统计学方法为单因素方差分析。

2 结果

2.1 ATP诱导的钙离子释放被P2YR-PLC-IP3通路拮抗剂抑制

在原代培养的缘细胞中，加入30μmol/L ATP后，钙离子荧光强度增强，2分钟时荧光强度最大值(Fmax/F0)为2.379±0.639。在预先加入非选择性P2Y嘌呤受体抑制剂100 μmol/L Suramin，再加入30μmol/L ATP后，钙离子释放几乎完全被抑制（Fmax/F0=1.017±.063，P＜0.05），说明ATP诱导的钙离子依赖于P2Y受体的参与。当预先加入100μmol/L IP3受体拮抗剂2-APB和内质网钙库拮抗剂TG后，2-APB组(Fmax/F0=1.01±0.082)和TG组(Fmax/F0=1.02±0.067）钙离子荧光强度相较于ATP处理组显著降低(P＜0.05)，而与Suramin组对比无明显变化，说明在细胞外液无钙离子的情况下ATP诱导的内质网钙离子释放完全依赖于P2YR-PLC-IP3信号系统作用内质网，诱导钙离子从中释放。见图1，图4。

图1 ATP诱导的内质网钙离子释放可以被P2YR-PLC-IP3通路拮抗剂所抑制Fig.1 ATP-evoked ER Ca2+responses can be blocked by P2YR-PLC-IP3 inhibitors.A.ATP诱导缘细胞内钙离子释放；B-D ATP诱导的钙离子释放可以完全被P2YR-PLC-IP3嘌呤信号受体抑制剂拮抗。A.ATP can evoke Ca2+responses of marginal cells;B-DATP-evoked Ca2+responses can be completely blocked by P2YR-PLC-IP3 inhibitors.

2.2 GPN诱导钙离子荧光强度升高和溶酶体裂解

在加入200 μmol/L GPN 3分钟后，钙离子荧光探针（绿色）强度增强，同时溶酶体荧光探针（红色）染色消失。在GPN的作用下，溶酶体裂解仅用了3分钟，而钙离子的反应性升高持续了约15分钟，说明溶酶体裂解后对内质网钙库释放存在促进作用。见图2。

图2 GPN诱导钙离子荧光强度升高和溶酶体裂解Fig.2 GPN evoked Ca2+responses and lysosomes lysis.

2.3 GPN诱发的钙离子反应被P2YR-PLC-IP3通路拮抗剂抑制

在原代培养的缘细胞中加入200 μmol/L GPN后，钙离子荧光强度逐渐升高且持续了约15分钟，而溶酶体荧光探针染色在3分钟内消失（图2）。而在预先分别加入P2YR和IP3受体抑制剂100 μmol/L Suramin和100 μmol/L 2-APB孵育15分钟，再加入200 μmol/L GPN 3分钟后，Suramin组(Fmax/F0=1.61±0.23)和2-APB(Fmax/F0=1.640.18)组钙离子荧光强度相较于单独加入GPN组(Fmax/F0=2.46±4.12)显著降低（P＜0.05），说明P2Y嘌呤受体在GPN诱导的钙离子反应中起作用，钙离子反应并未完全被抑制。在加入内质网钙库耗竭剂5μmol/L TG预先孵育15分钟，再加入GPN 2分钟后，钙离子荧光强度相较于嘌呤受体抑制剂组显著降低（Fmax/F0=1.32±0.14,P＜0.05），说明在内质网钙库未被完全拮抗前，溶酶体内钙离子对内质网钙库释放有促进作用。见图3，图4。

图3 P2YR-PLC-IP3通路拮抗剂可以抑制GPN诱导的内质网钙离子释放Fig.3 GPN-evoked ER Ca2+responses can be blocked by P2YR-PLC-IP3 inhibitors

图4 P2YR-PLC-IP3通路抑制剂对于ATP和溶酶体膜裂解剂（GPN）诱导的钙离子反应的抑制作用。Fig.4 ATPandGPN-evokedERCa2+responsescanbeblocked by P2YR-PLC-IP3 inhibitors.A：P2YR-PLC-IP3通路抑制剂对于ATP诱导的钙离子反应的抑制作用，ATP组胞内钙离子释放浓度显著强于预先孵育P2YR-PLC-IP3通路抑制剂组，有统计学意义*P＜0.05。B：P2YR-PLC-IP3通路抑制剂对于GPN诱导的钙离子反应的抑制作用，GPN组胞内钙离子释放浓度显著强于预先孵育P2YR-PLC-IP3通路抑制剂组，有统计学意义·*P＜0.05。预先孵育Suramin和2-APB组胞内钙离子释放浓度显著高于预先孵育TG组，有统计学意义**P＜0.05。C:BAPTA-AM对于细胞内钙离子反应的抑制作用，BAPTA-AM组胞内钙离子释放浓度显著低于对照组，有统计学意义*P＜0.05。A:ATP-evoked ER Ca2+responses can be blocked by P2YR-PLC-IP3 inhibitors,*P<0.05 compared with P2YP-PLC-IP3 inhibitors.B:GPN-evoked ER Ca2+responses can be blocked by P2YRPLC-IP3 inhibitors.*P<0.05 compared with P2YR-PLC withP2YR-PLC-IP3inhibitors.**P<0.05comparedwith pre-incubation with Suramin and 2-APB.C:ER Ca2+responses can be blocked by BAPTA-AM,**P<0.05 compared with control.

2.4 缘细胞中ATP释放依赖于钙离子诱导的溶酶体胞吐作用

在加入钙离子拮抗剂50 μmol/L BAPTA-AM后，细胞内钙离子荧光强度、ATP浓度均降低，说明缘细胞外ATP的释放依赖于细胞内的钙离子。在加入5 μmol/L TG后和200 μmol/L GPN后，ATP释放量较未处理组显著升高，TG+GPN处理组（4.67±0.47μmol）较GPN处理组（7.00±0.63μmol）显著降低（P＜0.05），说明缘细胞中ATP的释放量与钙离子浓度呈正相关。同时，加入GPN和TG后，β-氨基己糖苷酶释放率与ATP释放增高的趋势相同，说明细胞外ATP浓度与溶酶体胞吐作用呈正相关，两者又与细胞内钙离子浓度呈正相关，ATP的释放依赖于溶酶体的胞吐作用，溶酶体的胞吐作用又依赖于胞内钙离子浓度。见图4，图5。

图5缘细胞中的ATP和β-氨基己糖苷酶释放率是钙依赖性的Fig.5 Release of ATP and β-hexosaminidase are Ca2+dependent in marginal cellsA.ATP在未处理组、TG+GPN组、GPN组和BAPTA-AM组中的释放量（n=9）。TG+GPN组较未处理组显著升高，有统计学意义*P＜0.05;GPN组较未处理组和TG+GPN组显著升高，有统计学意义**P＜0.05;BAPTA-AM组较未处理组显著降低，有统计学意义#P＜0.05。B.β-氨基己糖苷酶在TG、GPN处理因素下的释放量(n=3)。TG组较对照组显著升高，有统计学意义*P＜0.05;GPN组较TG组显著升高，**P＜0.05有统计学意义。A.Release of ATP of untreated、TG+GPN and BAPTA-AM(n=9).*P<0.05 compared with untreated;**P<0.05 compared with TG+GPN;#P<0.05 compared with untreated.B.Release of β-hexosaminidase under treatment with TG and GPN.*P<0.05 compared with control;**P<0.05 compared with GPN.

3 讨论

在哺乳动物耳蜗中，ATP作为一种神经递质广泛参与了听觉的形成、蜗内电位的产生以及内耳中钾离子的循环[13]。血管纹在维持耳蜗内稳态、产生耳蜗内电位（EP）、参与内淋巴液形成以及K+的分泌与循环等方面有着重要作用[14]。作为耳蜗内ATP重要的来源之一，关于缘细胞的研究，最早由White等[15]用一种ATP特异性结合染料喹丫因对缘细胞处理后，发现ATP以囊泡的形式储存在细胞中，但未具体阐述是何种细胞器。在我们之前的研究中[6]发现，ATP以囊泡的形式储存在溶酶体，并且在加入溶酶体膜裂解剂后，在电镜下发现ATP以囊泡的形式胞吐出细胞膜，但未能阐明ATP是以何种机制释放至细胞外。在单核细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞中，ATP被证实是通过钙离子依赖性的溶酶体胞吐作用释放至细胞外[11,12,16]。在哺乳动物耳蜗中，Zhao等[13]发现了一种表达于细胞膜的Pannexin1（Panx1）通道，可以作为一种非结合性的通道释放ATP，广泛表达于耳蜗外侧壁，但在缘细胞上未发现其存在。在Zhao等[17]的研究中还发现耳蜗中存在一种缝隙连接（gap junction），连接于细胞间，通过在细胞间释放IP3进而促进ATP的释放，但未在缘细胞中发现表达。ATP通过P2Y和P2X两种受体发挥作用，P2Y和P2X受体在耳蜗中广泛表达。在P2Y受体中，P2Y4和P2Y2受体在不同学者的研究中均认为表达于耳蜗血管纹，尚不清楚是否表达于缘细胞[18,19]。在国内Liu等[20]的研究中，IP3受体在新生大鼠耳蜗中主要表达于内外毛细胞和血管纹。

在我们的研究中，当加入非选择性P2嘌呤受体抑制剂Suramin时，ATP诱导的钙离子反应可被抑制。据报道，Suramin主要抑制可被ATP和UTP激活的P2Y2受体，而不能抑制P2Y4受体[21]。同样的现象在间充质干细胞、分离的胰岛细胞中也被发现，说明ATP诱导的胞内钙离子释放依赖于P2Y嘌呤受体的参与[10,22]。然而，国外学者发现ATP在平滑肌细胞中可以通过IP3受体抑制钙离子从内质网释放[23]。当预先加入P2YR-PLC-IP3拮抗剂，再加入GPN后，钙离子荧光强度显著被抑制；在加入BAPTA-AM(钙离子拮抗剂)后，钙离子荧光强度降低的同时，ATP释放量降低，说明ATP在缘细胞内是以钙离子依赖的方式释放。在培养的缘细胞中预先加入TG，再加入GPN后，此时钙离子荧光强度较加入Suramin和2-APB时显著降低，即当TG把内质网钙库耗竭后，GPN不能使TG处理过的缘细胞外液中ATP含量增加，说明溶酶体在GPN作用后对内质网钙库释放具有促进作用。钙离子在细胞内外广泛存在，在胞内主要储存在酸性细胞器中包括线粒体、溶酶体和高尔基体中[24]。在成纤维细胞中，发现溶酶体储存的钙离子在溶酶体裂解后可以通过IP3和兰尼碱受体触发内质网钙库进一步释放[25]。兰尼碱受体广泛表达于哺乳动物耳蜗中，在新生和成熟大鼠中，均发现表达于血管纹[26,27]。国外近期研究发现溶酶体作为非标准性钙库，通过内质网上的IP3受体和兰尼碱受体释放钙离子从而促进钙离子动员信使NAADP（Nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate）的产生，作用于溶酶体膜表面的TPCs(two-pore channels)促进溶酶体中的钙离子释放，释放至胞质中的钙离子通过作用于内质网上的IP3受体和兰尼碱受体，从而达到钙触发钙释放（CICR）[28]。这与我们在ATP释放实验和β-氨基己糖苷酶释放率实验中，所观察到的趋势相一致，说明在内质网钙库衰竭后，GPN作用后释放出的钙离子不能再对内质网钙库起作用。ATP释放量与溶酶体胞吐作用呈正相关，前者与钙离子的荧光强度呈正相关，目前关于ATP如何在溶酶体中聚集的机制尚不明确，国外学者[29]认为ATP可以通过结合于溶酶体膜上的ATP结合盒蛋白（ATP-binding-cassette proteins）在质子泵的作用下进入溶酶体，但具体的机制有待进一步研究。Muñoz等[30]发现当血管纹缘细胞处于噪声刺激时，释放至内淋巴的ATP含量增加。在缺氧的Hela细胞中，ATP储存于自噬溶酶体中，并通过VAMP7结构依懒性方式释放至胞外[31]。在缺氧的成骨细胞中，当加入自噬抑制剂6-氨基-3-甲基嘌呤后，胞外ATP的浓度显著降低，同时激活Caspase3/7介导的细胞凋亡通路[32]。目前在国内外，尚无关于耳蜗血管纹缘细胞在病理状态下ATP释放机制的研究。

本研究结果提示：在新生大鼠耳蜗血管纹缘细胞中，细胞外ATP通过P2YR-IP3-PLC通路触发的内质网钙库释放，可以促进溶酶体的胞吐作用，从而将ATP以囊泡的形式释放到胞膜外，从而发挥其生物学功能。