STC 1-siRNA对甲状腺乳头状癌细胞增殖和凋亡的影响及机制

王明军，毛秋粉，刘金彪，王宁，汲权威，侯永强，王新征

河南科技大学临床医学院/河南科技大学第一附属医院，1甲状腺外科，2核医学科，河南 洛阳 471003

甲状腺癌是头颈部及内分泌系统常见的恶性肿瘤，多见于女性。据统计，近年来甲状腺乳头状癌的发病率呈现上升趋势[1-2]。近年来，生物治疗及分子检测技术的发展使多种疾病的诊疗步入新台阶，肿瘤早期检测技术不断发展，寻找甲状腺癌发生发展的分子机制具有重要意义。斯钙素1（stanniocalcin 1，STC1）位于染色体8p11.2-p21，是一种糖蛋白激素，在人体的多种组织及各个脏器中均表达，以旁分泌或自分泌形式参与血管生成、妊娠等多种生理过程[3]。研究显示，甲状腺癌、肾癌、乳腺癌组织中STC1的表达水平均高于正常组织，STC1可能是一种新型的肿瘤标志物[4-6]。在肺癌细胞中，通过RNA干扰抑制STC1的表达可抑制肿瘤细胞的增殖，阻滞细胞周期，并促进肿瘤细胞凋亡[7]。研究表明，甲状腺癌中STC1的高表达与临床分期及淋巴结转移有关[8]，然而关于STC1与甲状腺乳头状癌细胞生物学特性的关系尚未清楚。本研究通过RNA干扰技术抑制甲状腺乳头状癌K1细胞中STC1的表达，并检测细胞的增殖和凋亡情况，研究其可能的分子机制，现报道如下。

1 材料方法

1.1 细胞及主要试剂和仪器

甲状腺乳头状癌K1细胞购自中国科学院上海细胞库。DMEM培养基、胎牛血清、OPTI-MEM培养基均购自美国Gibco公司；LipofectamineTM2000脂质体转染试剂盒购自美国Invitrogen公司；CCK8细胞增殖试剂盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）试剂盒均购自碧云天生物技术研究所；膜联蛋白V（Annexin V）-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）细胞凋亡试剂盒及流式细胞仪均购自美国BD公司；STC1、B细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，BAX）、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）、磷酸化的AKT（phosphorylated AKT，p-AKT）抗体均购自美国Abcam公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体购自上海钰博生物科技有限公司。酶标仪购自美国Bio Tek公司。

1.2 细胞培养及分组

采用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养甲状腺乳头状癌K1细胞，置于37℃、5%CO2的培养箱内培养，取生长至对数期的细胞。将甲状腺乳头状癌K1细胞分为空白对照组、阴性对照组和STC1-siRNA组，阴性对照组和STC1-siRNA组分别为转染NC-siRNA和STC1-siRNA的细胞，空白对照组为未转染的细胞。

1.3 siRNA的构建和转染

实验前1天使用含血清无双抗培养基铺6孔板，细胞密度为6×105/孔，待细胞达60%融合度时开始转染。取1.5 ml的EP管，加入50 μl OPTIMEM培养基，再加入5 μl STC1-siRNA或NC-siRNA，室温中静置5 min，制备成A溶液。另取1.5 ml的EP 管，加入 50 μl OPTI-MEM，再加入 2 μl LipofectamineTM2000，室温中静置5 min，制备成B溶液。轻轻混合A液和B液，室温中静置20 min。将混合液加入已含OPTI-MEM的6孔细胞培养板中，轻轻混合均匀，置于培养箱中培养8 h，换为含血清无双抗的培养基继续培养。

1.4 蛋白质印迹（Western blot）法检测STC 1蛋白及Bcl- 2、BAX、AKT和p-AKT蛋白表达

收集转染48 h的3组细胞，采用BCA试剂盒对蛋白浓度进行测定，100℃水浴10 min，取等量的变性蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），电转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，洗膜后采用5%的脱脂奶粉室温封闭1 h，4℃孵育一抗（1∶1000稀释的STC1、Bcl-2、BAX、AKT、p-AKT及内参GAPDH抗体）过夜，次日去除一抗，洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（1∶1000），37℃孵育45 min，洗膜，置于暗室中，应用蛋白荧光检测试剂盒在X光片上显示结果。

1.5 CCK 8检测细胞增殖

将生长至对数期的甲状腺乳头状癌K1细胞，3000 r/min离心10 min，弃上清液，制备成细胞悬液，以5×103/100 μl铺至96孔细胞培养板中，培养24 h以进行同步化处理，按照1.3中的方法将siRNA转染细胞，每组设置5个复孔，并设置空白对照，分别于转染后24、48、72 h收集细胞，每孔中加入CCK8溶液10 μl，37 ℃孵育4 h。空白对照孔调零，置于酶标仪上测定490 nm处的光密度（optical density，OD）值。实验重复3次。

1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡

收集转染48 h后的3组细胞，应用结合缓冲液重悬细胞，将细胞浓度调整为1×106/ml，在离心管中加入细胞悬液100 μ（l约含有1×105个细胞），再分别加入Annexin V-FITC和PI各5 μl，轻轻混合均匀，置于避光环境中常温（25℃）孵育15 min，再在各组细胞中加入结合缓冲液400 μl，1 h内应用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况。实验重复3次。

1.7 ROS水平检测

收集转染48 h后的3组细胞，采用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤细胞，加入含有20 μmol/L 2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯的PBS，置于37℃、5%CO2的培养箱内培养2 h，加入不含胎牛血清的培养液洗涤细胞，重悬细胞后，应用流式细胞仪检测激发波长为488 nm和发射波长为525 nm处各组细胞的荧光强度。以荧光强度反映细胞内活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）水平。实验重复3次。

1.8 统计学方法

采用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 STC 1蛋白表达水平的比较

Western blot检测结果显示，空白对照组、阴性对照组和STC1-siRNA组中STC1蛋白的相对表达量分别为（0.452±0.049）、（0.478±0.054）、（0.106±0.011），3组比较，差异有统计学意义（F=71.380，P＜0.01）。阴性对照组和空白对照组中STC1蛋白的相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；STC1-siRNA组中STC1蛋白的相对表达量明显低于空白对照组，差异有统计学意义（t=9.953，P＜0.01）。（图1）

图1 Western blot检测甲状腺乳头状癌K 1细胞中STC 1蛋白的表达情况

2.2 细胞增殖活性的比较

转染24、48、72 h后，空白对照组、阴性对照组和STC1-siRNA组细胞的OD值比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。转染24、48、72 h后，STC1-siRNA组细胞的OD值均明显低于空白对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表1）

表1 不同时间点各组细胞OD值的比较

2.3 细胞凋亡率的比较

转染48 h后，空白对照组、阴性对照组和STC1-siRNA组细胞的凋亡率分别为（3.11±0.62）%、（3.18±0.65）%和（16.66±1.54）%，3组比较，差异有统计学意义（F=172.401，P＜0.01）。STC1-siRNA组细胞的凋亡率明显高于空白对照组，差异有统计学意义（t=16.123，P＜0.01）。（图2）

图2 流式细胞仪检测甲状腺乳头状癌K 1细胞的凋亡情况

2.4 ROS水平的比较

空白对照组、阴性对照组和STC1-siRNA组细胞的 ROS水平分别为（105.8±8.9）、（107.7±9.2）和（146.8±10.3），3组比较，差异有统计学意义（F=17.856，P＜0.01）。STC1-siRNA组细胞的ROS水平明显高于空白对照组，差异有统计学意义（t=5.294，P＜0.01）。

2.5 Bcl- 2、BAX、AKT和p-AKT蛋白表达水平的比较

Western blot检测结果显示，空白对照组、阴性对照组和STC1-siRNA组中Bcl-2、BAX、p-AKT蛋白的相对表达量比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）；空白对照组、阴性对照组和STC1-siRNA组中AKT蛋白的相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。STC1-siRNA组中Bcl-2、p-AKT蛋白的相对表达量均明显低于空白对照组，BAX蛋白的相对表达量明显高于空白对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表2、图3）

表2 3组细胞中Bcl- 2、BAX、AKT和p-AKT蛋白相对表达量的比较

图2 Western blot检测甲状腺乳头状癌K 1细胞中Bcl- 2、BAX、AKT和p-AKT蛋白的表达情况

3 讨论

在研究甲状腺乳头状癌的分子机制中发现，核因子κB（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cell，NF-κB）、磷脂酰肌醇 3-羟激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/AKT、WNT/β-连环蛋白（β-catenin）、缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor 1 subunit alpha，HIF-1α）等多种信号通路参与甲状腺乳头状癌的发生发展[9-11]。本研究中的STC1基因与上述多种信号通路有密切联系。STC1最早被发现于硬骨鱼的内分泌腺，是一种可调节钙磷代谢的糖蛋白激素，多种肿瘤中出现STC1表达的升高，其与患者的临床分期、病理分级及预后有密切关系[12-13]。研究显示，子宫颈癌中STC1可通过激活NF-κB信号通路抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移能力[14]；肺腺癌中STC1可通过激活JNK和ERK信号通路诱导Bcl-2和BclxL等抗凋亡蛋白的表达，同时抑制BAK、BAX和BID等促凋亡蛋白的表达，从而抑制肿瘤细胞的凋亡[15]。提示STC1可能成为新的治疗甲状腺乳头状癌的靶点。

RNA干扰是由双链RNA诱导的使mRNA序列降解的现象，是近年来发现和发展起来的基因阻断技术，具有高效性、特异性等特点，是研究基因功能的有效途径[16-17]。本研究中将STC1-siRNA转染至甲状腺乳头状癌细胞，通过CCK8及流式细胞术分别检测细胞的增殖和凋亡情况，结果发现转染24、48、72 h后细胞的增殖活力均下降，转染48 h后，细胞的凋亡率升高。甲状腺乳头状癌的发生发展涉及多方面，Bcl-2基因家族是细胞凋亡过程中重要的执行因子，Bcl-2和BAX基因均属于Bcl-2基因家族，其中Bcl-2发挥抗凋亡作用，而BAX发挥促凋亡作用，两者具有拮抗作用，在调控细胞凋亡中发挥关键作用[18]。细胞的生存状态与ROS的累积程度有关，适量的ROS累积可促进肿瘤细胞的存活，而过度的ROS累积可导致细胞的氧化应激损伤甚至细胞死亡[19]。研究显示，甲状腺乳头状癌中ROS水平升高与细胞凋亡密切相关[20]。PI3K/AKT是一条重要的细胞内信号转导通路，影响细胞的生长、凋亡、分化、血管生成等过程[21]。PI3K/AKT信号通路被激活后，AKT发生磷酸化，作用于下游的多个靶点，促进肿瘤的发生发展。研究发现，甲状腺乳头状癌中PI3K/AKT信号通路被激活，磷酸化的AKT表达升高，可促进肿瘤细胞生长，抑制肿瘤细胞凋亡，抑制该信号通路后作用相反[22]。本研究发现，抑制甲状腺乳头状癌中STC1的表达可导致BAX和ROS的表达水平升高，Bcl-2和p-AKT的表达水平下降。说明抑制STC1的表达可抑制甲状腺乳头状癌细胞中的AKT信号通路，使抗凋亡基因的表达下调，促凋亡基因的表达上调。

综上所述，抑制甲状腺乳头状癌中STC1基因的表达可降低肿瘤细胞的增殖活力，诱导肿瘤细胞凋亡，其作用机制可能与下调AKT信号通路有关。本研究提示STC1可能是甲状腺乳头状癌分子诊断及治疗的新靶点，但目前关于STC1在甲状腺乳头状癌中的研究并不多，本研究也只在细胞水平分析了STC1的作用及可能的分子机制，还需更多的实验数据及体内研究进一步证实。