银耳多糖的降解、磷酸酯化修饰及其抗氧化活性

陈 鹏,颜 军,梁 立,刘 嵬,苟小军,何 钢

(药食同源植物资源开发四川省高校重点实验室,四川抗菌素工业研究所,成都大学,四川成都 610052)

银耳(Tremellafuciformis)是银耳科银耳属食用菌,具有滋阴润肺、开胃健脾的功效[1],现代医学研究表明,多糖是银耳的主要活性成分,具有抗氧化、降血脂、抑菌等多种生物活性[2,3]。多糖的糖苷键种类、连接方式以及空间结构会影响多糖的抗氧化、降血脂、免疫等生物活性[4]。由于多糖的结构复杂,解析较为困难,多糖的构、效关系研究进展缓慢,常见的方法是将多糖进行部分降解,解析活性结构单元,以及对多糖进行结构修饰[5]。

常用的多糖的结构修饰方法有甲基化、乙酰化、硫酸酯化、磷酸酯化等方法[6,7]。磷酸酯化修饰是指使多糖的羟基被磷酸酯基团取代,已有研究表明,多糖磷酸酯化能够增强多糖的部分生物活性[8]。如龙眼多糖磷酸酯化修饰后,能够增强其抗肿瘤、抗菌活性[9];南瓜多糖磷酸酯化修饰后,增强了南瓜多糖的抗氧化活性[10]。银耳多糖具有诸多生物活性,已有研究表明,银耳多糖硫酸酯化、羧甲基化、乙酰化修饰能够改善溶解性和增强活性,而磷酸酯化修饰研究报道较少。银耳多糖相对分子质量大、溶解性差[11],难以直接进行磷酸酯化修饰。有研究表明,多糖经部分降解后,溶解性会随着分子量的降低而增强[12,13],因此可将银耳多糖进行部分降解,将获得的低分子量银耳多糖再进行磷酸酯化修饰。

本文为以双氧水-VC体系对银耳多糖(Tremellapolysaccharide,TP)进行氧化降解,得到降解银耳多糖(DegradedTremellapolysaccharide,DTP),采用三氯氧磷和吡啶对其进行磷酸酯化修饰,并测定修饰后的银耳多糖(Phosphate degradedTremellapolysaccharide,PDTP)的抗氧化活性,旨在为后续深入研究银耳多糖的构效关系提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

银耳子实体:通江银耳 通江裕德源公司;乙醇、氯仿、正丁醇、三氯氧磷、磷酸二甲酯、硫酸、硝酸、双氧水、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基、磷酸二氢钾、氢氧化钠、钼酸铵、硫酸亚铁、水杨酸 均为市售分析纯;KBr 光谱纯 成都市科龙化工试剂厂;葡聚糖(DextranT-10,40、70、500、2000)透析袋(3000 Da) 北京索莱宝科技有限公司。

L-2000液相色谱仪 日立科学仪器有限公司;紫外可见光分光光度仪 尤尼柯仪器有限公司;傅里叶红外光谱仪 赛默飞公司;CT15RT型高速台式冷冻离心机 上海天美科学仪器有限公司；GL-21M型高速冷冻离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司;FD-1C-55型冻干机 北京博医康实验仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 银耳多糖的制备 参考文献[14]方法,称取100 g干燥银耳粉,料液比1∶30 g/mL,提取温度100 ℃,提取时间4 h,提取液8000 r/min离心10 min,取上清液浓缩,加入4倍体积无水乙醇过夜沉淀。8000 r/min离心10 min,收集多糖沉淀,加入100 mL蒸馏水复溶,8000 r/min离心10 min,除去沉淀,上清液用Sevage试剂除蛋白质等杂质,直到溶液在蛋白质最大吸收波长280 nm和核酸最大吸收波长254 nm处无吸收为止,透析48 h,将银耳多糖溶液于-40 ℃真空冷冻干燥24 h,得到银耳多糖(TP)。

1.2.2 银耳多糖的氧化降解 参考Duan K等的方法[15],称取1 g银耳多糖于500 mL锥形瓶中,加100 mL蒸馏水使其溶解,加入100 mL VC溶液(10 mmol/L)、300 mL H2O2溶液(10 mmol/L),反应2 h。将反应液透析24 h,透析液7000 r/min离心10 min,将上清液于-40 ℃真空冷冻干燥24 h,获得低分子量银耳多糖样品(DTP)。

1.2.3 银耳多糖分子量测定 采用高效凝胶渗透色谱法(High performance gel permeation chromatography,HPGPC)测定。色谱条件:色谱柱为YMC PACK-Diol 200 Å(300 mm×8.0 mm ID,5 μm,20 nm),流动相为蒸馏水;流速0.8 mL/min,柱温30 ℃;检测器为示差折光检测器;进样量20 μL。

将降解前后的多糖样品及葡聚糖标准品配制成5 mg/mL溶液,分别进样分析,求得线性方程。将降解前后多糖样品的保留时间代入线性方程,计算多糖的相对分子质量。

1.2.4 磷酸酯化银耳多糖的制备 按照文献[9]中的方法,称取20 mg低分子量银耳多糖于圆底烧瓶中,加蒸馏水5 mL、吡啶10 mL,冰浴下用6 mol/L氢氧化钠溶液,调节pH至12。缓慢滴加三氯氧磷10 mL、磷酸三甲酯3 mL,随后45 ℃水浴反应4 h,反应结束后,用4 mol/L盐酸溶液调节pH至7,蒸馏水透析48 h,于-40 ℃真空冷冻干燥24 h,得到磷酸酯化银耳多糖(PDTP)。

1.2.5 磷酸酯化银耳多糖取代度的测定 移取不同浓度的磷标准溶液10 mL,依次加入钼酸铵溶液4 mL和0.05 mol/L VC溶液2 mL。置于100 ℃水浴加热10 min,随后冷却至室温,以空白溶液为对照,于824 nm测吸光度值。以磷浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制磷标准曲线[16]。

取20 mg酯化银耳多糖倒入消化瓶内,加入1.5 mL硫酸-硝酸混合溶液,逐渐加热,待溶液变得澄清后,加入4.5 mL蒸馏水,调节pH至7,并按上述磷标准溶液处理方法进行处理,最后测得吸光度代入线性回归方程,求得磷酸酯化多糖的磷含量。

式中,M为样品中的磷含量(%)。

1.2.6 银耳多糖水溶解度的测定 采用高速离心法[17]测定银耳多糖的水溶解度,称取60 mg DP、DTP、PDTP,加入1 mL蒸馏水溶解,15000 r/min离心10 min,移除上清液,将底部沉淀烘干至恒重,两次重量之差即为银耳多糖水溶解度。

1.2.7 银耳多糖红外光谱分析 称取磷酸酯化修饰前后的银耳多糖各5 mg,加入5 mg KBr研磨均匀,随后取2 mg粉末压片并进行红外光谱分析,扫描范围为400～4000 cm-1。

1.2.8 银耳多糖抗氧化活性的测定

1.2.8.1 银耳多糖羟自由基清除能力的测定 分别取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mg/mL TP、PDTP和DTP溶液各1.0 mL,加入FeSO4溶液2.0 mL、水杨酸-乙醇1.5 mL、H2O20.1 mL,混匀后,37 ℃反应30 min,于510 nm处测量吸光度值。以1.0 mL蒸馏水代替多糖溶液作为空白对照[18]。

羟自由基清除率(%)=[(A0-As)/A0]×100

式中,A0为空白管的吸光度,As为加入样品后的吸光度。

1.2.8.2 银耳多糖DPPH自由基清除能力的测定 分别取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mg/mL TP、PDTP和DTP溶液各0.1 mL,加入3.9 mL 0.1 mmol/L DPPH(95%乙醇配制)溶液,涡旋混匀,避光37 ℃反应30 min,离心10 min;取0.1 mL纯水,加入3.9 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液混匀作空白对照。混匀后暗处反应30 min,于517 nm处测定吸光度值[19]。

DPPH自由基清除率(%)=(1-As/A0)×100

式中,A0为空白管的吸光度,As为加入样品后的吸光度。

1.3 数据处理

采用SPSS 19.0软件进行数据处理,所有实验均重复操作3次,实验结果均表示为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 银耳多糖的相对分子质量分析

高效凝胶渗透色谱法(High performance gel permeation chromatography,HPGPC)是测定样品相对分子质量的常用方法,银耳多糖的相对分子质量图谱如图1所示。以标准葡聚糖保留时间为横坐标,相对分子质量的对数为纵坐标作图,得线性回归方程Y=-0.5609X+9.0527,r=0.9722(X为保留时间,Y为分子量对数),将降解前后样品保留时间代入方程计算,降解前银耳多糖的相对分子质量范围为40.27～65.33 kDa,降解产物经透析后获得一个单一组分,其相对分子量为7.82 kDa。

图1 银耳多糖的相对分子质量图谱Fig.1 Molecular weight chromatogram of Tremella polysaccharide

2.2 银耳多糖的红外光谱分析

红外光谱是表征样品特征吸收基团的常用手段,银耳多糖的红外光谱图如图2所示。由图2可知,3413.10 cm-1处的吸收峰是由多糖的羟基伸缩振动引起的;1670.35 cm-1处的吸收峰是多糖C=O伸缩振动峰,表明银耳多糖中含有糖醛酸;1088.15 cm-1处的吸收峰是多糖C-O的变角振动吸收峰[20],这几处吸收峰为银耳多糖的特征吸收峰。与DTP谱图相比,1262.22 cm-1处的吸收峰为P=O的特征吸收峰,540.55 cm-1处的吸收峰为磷酸酯键的特征吸收峰,表明银耳多糖磷酸酯化成功。

图2 银耳多糖的红外光谱图Fig.2 Infrared spectrum of Tremella polysaccharide

2.3 磷酸酯化银耳多糖取代度的测定结果

如图3所示,磷标准曲线方程为Y=0.0517X+0.0073,r=0.9989(X为标准品磷的浓度,Y为吸光度)。在0～10 μg/mL范围内,浓度与吸光度值线性关系良好。将样品吸光度值代入曲线,计算后得出样品的磷含量为0.41%,取代度Ds为0.021。

图3 磷标准曲线Fig.3 The standard curve of phosphorus

2.4 银耳多糖水溶解度的测定结果

银耳多糖水溶解试验结果见表1。由表1可知,降解前银耳多糖的溶解度为15.33±1.51 mg/mL,降解后低分子量银耳多糖的溶解度为30.45±1.23 mg/mL,磷酸酯化修饰后银耳多糖的溶解度为42.71±1.67 mg/mL,表明氧化降解及磷酸酯化修饰能明显改善银耳多糖的水溶解度。

表1 银耳多糖水溶解度Table 1 The water solubility of Tremella polysaccharide

2.5 银耳多糖的抗氧化活性研究

2.5.1 银耳多糖清除羟自由基的能力 多糖组分对羟自由基的清除率结果如图4所示。由图4可知,随着浓度增大,VC和各组分多糖对羟自由基的清除能力逐渐增强,在2.4 mg/mL时,清除效率最高,VC清除率为99.6%,TP清除率为38.23%,DTP清除率为50.34%,PDTP清除率为67.45%。PDTP清除羟自由基的IC50为1.14 mg/mL,DTP清除羟自由基的IC50为2.35 mg/mL,而TP在最大浓度2.4 mg/mL时的清除率仍未达到50%。结果表明,TP、DTP、PDTP对羟自由基的清除效果随浓度增加逐渐增强。多糖体外清除羟自由基的假设机理是羟自由基夺取银耳多糖碳链上的活泼氢原子,与之结合成水;剩下的碳原子失去氢原子后成为碳自由基,进一步氧化成过氧化自由基,最后分解成无害的物质[21]。高分子量的银耳多糖链之间相互缠绕、结构复杂,可被羟自由基获取的氢原子数量少,经过氧化降解后多糖链有部分断裂,水溶解度增加,被羟自由基获取的氢原子数量增加[22,23],因此DTP对羟自由基的清除效果相比TP更好。据报道,黑加仑多糖[24]和龙须菜多糖[25]降解后对羟自由基的清除率显著提高。对DTP进行磷酸酯化修饰过后,引入的磷酸酯键改变了多糖原有的空间结构,PDTP的水溶解度为42.71±1.67 mg/mL,比TP、DTP更高,在反应中可被羟自由基获取的氢原子数更多,因此PDTP羟自由基的清除效果优于DTP。

图4 银耳多糖对羟自由基的清除率Fig.4 Hydroxyl radical scavenging activity of Tremella polysaccharide

2.5.2 银耳多糖清除DPPH自由基的能力 多糖组分对DPPH自由基的清除率结果如图5所示。由图5可知,在0.4～2.4 mg/mL范围内,VC对DPPH自由基清除率接近100%,三个多糖组分对DPPH自由基的清除能力均有剂量效应,浓度为2.4 mg/mL时,各多糖对DPPH自由基清除率最高,TP为37.15%,DT为65.24%,PDTP为73.77%。PDTP清除DPPH自由基的IC50为0.98 mg/mL,DTP清除DPPH自由基的IC50为2.05 mg/mL,而TP在最大浓度2.4 mg/mL时仍未达到50%清除率。结果表明,各浓度下对DPPH自由基的清除作用,PDTP>DTP>TP。DPPH自由基有单电子,自由基清除剂可与其单电子配对而使得紫外吸收逐渐消失[26]。对银耳多糖进行降解后,银耳多糖链的结构发生变化,水溶解度增加,DPPH自由基上孤对电子与多糖配对的空间位阻减小,采用三氯氧磷和吡啶体系对其进行磷酸酯化后,DPPH自由基可进一步夺取POCl2基团上的电子[27],因此PDTP在各浓度下对DPPH自由基的清除作用最好。

图5 银耳多糖对DPPH自由基的清除率Fig.5 DPPH radical scavenging activity of Tremella polysaccharide

3 结论

本研究中银耳多糖经双氧水-VC体系降解透析后,获得一个单一组分,相对分子质量为7.82 kDa;银耳多糖的水溶解度为15.33±1.51 mg/mL,经降解后增加到30.45±1.23 mg/mL,表明氧化降解能提高银耳多糖的水溶解度;磷酸酯化银耳多糖在1262.22、540.55 cm-1处出现了磷酸酯键吸收峰,采用磷钼蓝法测定样品的取代度为0.021,证明磷酸基团和银耳多糖结合成酯,修饰后银耳多糖的水溶解度提高为42.71±1.67 mg/mL。体外抗氧化实验表明,各浓度下的清除作用PDTP>DTP>TP,表明修饰后的低分子量银耳多糖对自由基的清除效果良好。本文对银耳多糖进行降解和磷酸酯化,提高了多糖的水溶解度和抗氧化活性,但其作用机制还有待深入研究,本研究结果可为银耳多糖的构效关系奠定基础。