乳酸菌发酵枸杞过程中理化指标及风味物质的变化

乔博鑫,邢紫娟,郭红莲

(天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津 300457)

枸杞(Lyciumbarbarum)为茄科(Solanaceae)枸杞属(Lyclum)植物,在我国宁夏、甘肃、青海等地广为种植[1-2],其果实含有多糖、脂类、维生素等营养成分,具有滋补肝肾、益精明目等作用,深受人们喜爱[3]。现代医学证明,枸杞具有调节机体免疫力、增强机体免疫力、抗氧化和抗衰老等多种药理功能[4]。作为传统的药食同源食品,枸杞的加工利用一直是人们关注和研究的重点。

乳酸菌是一类能从发酵性碳水化合物中产生大量乳酸的革兰氏阳性菌的统称,可明显改善食品风味,提高食品营养价值[3],同时乳酸菌又是具备多种功效的肠道有益菌,所以以枸杞为原料进行乳酸菌发酵,可能会产生许多美味又健康的食品。阎淳泰等[5]选用三种乳酸菌混合发酵枸杞汁72 h,得到了既有益生菌活力又有枸杞风味的乳酸菌饮料,郭红转[6]以保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌发酵枸杞汁与牛乳混合液,得到枸杞乳饮料;此外还有人用葡萄糖酵母、嗜酸乳杆菌混合发酵枸杞叶浸提浆,研制出口感独特的枸杞茶[7]等,这些研究在一定程度上揭示了乳酸菌类发酵枸杞的研究已引起人们的关注,但这些报导多是针对枸杞乳酸菌发酵的工艺条件进行的研究,而发酵后产品的风味成分及相关生理活性改变等方面的报导还较少。

本文以枸杞干果为原料,选用保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus,简称L.b)、嗜热链球菌(S.thermophilus,简称S.t)为微生物菌种对枸杞果榨汁进行发酵,研究了具有枸杞特有风味的乳酸菌饮料的发酵工艺条件,以便充分保存枸杞的有效成分和营养功效,满足消费者的口味和健康需求,同时对乳酸菌发酵过程中的枸杞汁生理成分及风味物质变化进行了探讨,确定其营养与风味的变化趋势,为枸杞发酵汁饮料的功能开发提供数据参考,同时为枸杞相关产品的工业化生产提供理论依据,对提高水果附加值等均具有重要现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

宁杞1号枸杞果实 宁夏农林科学院枸杞研究所提供;保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus,简称L.b)、嗜热链球菌(S.thermophilus,简称S.t) 天津科技大学菌种保藏中心;氢氧化钠 天津市化学试剂厂;葡萄糖 天津市大茂化学试剂厂;考马斯亮蓝G-250、3,5-二硝基水杨酸 国药集团化学试剂有限公司。

JYL-C010榨汁机 青岛九阳世家电器有限公司;TU-1810紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;MP522精密酸度计 上海三信仪表厂;PAL-1糖度计 日本爱拓公司;GCMS-QP2010Ultral气质联用仪 日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 乳酸菌菌悬液的制备 在无菌环境下,将保藏的菌粉接种于固体培养基上活化2次后,挑取平板上单菌落接种于MRS液体培养基中,37 ℃下培养24 h后,在4000 r/min条件下离心20 min,弃上清保留菌体。将菌体用无菌生理盐水清洗3次后,与无菌生理盐水混合,配制成浓度为1×108CFU/mL的菌悬液。

1.2.2 发酵工艺 工艺流程:

工艺要点:

前处理:剔除坏果、杂质,选取大小一致、色泽饱满、无机械损伤的干枸杞。

浸泡:冷水浸泡3 h。

打浆:将浸泡过的枸杞以一定量的料液比在榨汁机中打浆,使之成为枸杞液。

杀菌:90～95 ℃,30 s瞬时杀菌。

接种:将培养好的L.b、S.t菌按照1∶1体积混合后,在无菌操作下接种于枸杞液中。

发酵:选择合适的接种量添加到枸杞液中,在37 ℃条件下发酵。

1.2.3 单因素实验 通过预实验,确定以料液比、发酵时间、接种量为三个主要影响因素,以感官评价值为测试指标,确定发酵因素水平。

料液比:L.b、S.t按1∶1体积混合后,以3%接种量分别加入到料液比为4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1和14∶1 (g/100 mL)的枸杞液中,在37 ℃条件下恒温发酵24 h后,测定不同料液比的产酸量与感官评价值。

发酵时间:L.b、S.t按1∶1 (V/V)混合后,以3%接种量加入到料液比为8∶1 g/100 mL的枸杞液中,在37 ℃条件下分别发酵4、8、12、16、20、24、28、32、36、40 h后,测定不同发酵时间的产酸量与感官评价值。

接种量:将L.b、S.t按1∶1体积混合后分别以1%、2%、3%、4%、5%和6%的接种量加入到料液比8∶100 g/mL的枸杞液中,在37 ℃条件恒温发酵24 h后,测定不同接种量的产酸量与感官评分值。

1.2.4 正交试验 以料液比、发酵时间、接种量为影响因素,采用正交试验优化枸杞榨汁的发酵工艺,以感官评分值为指标,确定最佳发酵条件,因素和水平设置见表1。

表1 枸杞发酵工艺的试验因素水平表Table 1 Factors and levels for fermentation process of Lycium barbarum

1.2.5 感官评分 选取食品学院无饮食偏好的师生共9人组成评价小组,对发酵液的口感、外观、色泽、风味赋分,按照表2对发酵汁进行感官评定,每个测试样品的感官评分数据去掉最高和最低评分后取算术平均值。

表2 枸杞发酵液的感官评定表Table 2 Sensory evaluation of the fermented broth of Lycium barbarum

1.2.6 枸杞液发酵过程中理化指标分析 采用正交试验确定的最佳发酵条件对枸杞进行发酵,在37 ℃条件下每隔4 h测定以下指标:活菌数:参照GB4789.35-2016方法[8]进行;pH:利用酸度计测定;可滴定酸测定:按照GB/T12456-2008《食品中总酸的测定》测定[9];还原糖含量:利用3,5-二硝基水杨酸法测定[10];可溶性固形物:利用糖度计测定;可溶性蛋白:利用考马斯亮蓝G-250法测定[11]。

1.2.7 风味物质的测定 参照固相微萃取的方法,以GC-MS联用仪测定发酵后的风味物质[12]。样品以Rtx-5MS萃取头于60 ℃吸附萃取40 min,进样口解吸15 min。GC/MS-QP2010联用质谱检测,进样口温度250 ℃,进样方式:分流,分流比:10∶1,载气为He,纯度99.99%。全扫描范围30～550 m/z,溶剂延迟时间1.5 min。检测结果在NIST谱库检索,将匹配度大于80%的化合物作为暂定结果,查阅资料进行结果比对,以确定最终检测结果。

1.3 数据处理

试验采用Excel、SPSS 25.0及GraphPad Prism 7软件对数据进行统计。

2 结果与分析

2.1 乳酸发酵枸杞工艺

2.1.1 单因素实验结果 接种量料液比和发酵时间的单因素实验结果见图1～图3,各因素对感官评分值均具有显著性影响(p<0.05)。当料液比为8∶1 g/100 mL时,发酵液的感官评分值最佳(图1),乳酸菌发酵枸杞液的最适时间为24 h(图2),枸杞发酵液的感官评分值在接种量为3%时达最佳(图3)。

图1 料液比对发酵液感官品质的影响结果Fig.1 Effects of material liquid ratio on sensory quality of fermentation broth 注:不同小写字母代表差异显著,p<0.05,图2～图3同。

图2 发酵时间对发酵液感官品质的影响结果Fig.2 Effects of fermentation time on sensory quality of the fermented broth

图3 接种量对发酵液感官品质的影响结果Fig.3 Effects of inoculum on sensory quality of fermentation broth

2.1.2 正交优化结果 以枸杞发酵后的感官评分为指标,确定了影响枸杞发酵液的感官品质因素顺序为:发酵时间>接种量>料液比,最佳发酵条件为A2B2C3,即枸杞发酵饮料的工艺条件为接种量4%,料液比8∶1 g/100 mL,发酵时间24 h(表3),该条件下感官评分值为81分。

表3 枸杞发酵工艺的正交试验结果Table 3 Orthogonal test results of fermented Lycium barbarum

对上述工艺条件进行验证性发酵,结果确定发酵液口感酸甜,有枸杞特有的风味,感官评分为81分,与正交试验结果相符。

对感官评分进行方差分析(表4)可知,发酵时间对枸杞发酵液感官评分的影响具有极显著性差异(p<0.01),料液比和接种量对枸杞发酵液感官评分有显著性影响(p<0.05)。

表4 感官评分方差分析Table 4 Variance analysis of sensory scores

2.2 乳酸发酵枸杞过程中理化指标的变化

2.2.1 乳酸菌数量的动态 发酵液中的菌体数量在0～20 h内迅速增加(图4),这可能是由于乳酸菌利用发酵液中的可发酵糖等充足的营养物质进行繁殖和代谢的结果[13]。20 h后,活菌菌数上升趋势减慢,乳酸菌缓慢生长,进入稳定期。发酵28 h后,发酵液中的活菌数开始缓慢减少;发酵28～40 h内,发酵液中活菌数减少的速度呈慢-快-慢的趋势,这可能由于发酵饮料中营养物质消耗过多,产酸过多抑制了菌种的繁殖,菌种进入衰退期。

图4 发酵过程中活菌数变化曲线Fig.4 Change curve of viable cell count during fermentation

2.2.2 发酵液酸度的变化 由图5可以看出,随发酵时间的不断进行,发酵液中pH逐渐降低,可能是乳酸菌利用自身酶类物质使枸杞液中的碳水化合物和脂肪降解成有机酸或者脂肪酸[14]。当pH降至3.6(36 h)左右时,pH趋于稳定状态,这是因为发酵液中代谢产物积累,营养物质大量消耗。

图5 发酵过程中pH的变化Fig.5 Changes in pH during fermentation

2.2.3 发酵过程中可滴定酸的变化 酸度是衡量枸杞发酵饮料品质的重要指标。如图6在乳酸菌发酵枸杞榨汁的过程中,在发酵24 h前,发酵液中可滴定酸快速增加,24 h时枸杞液的酸度达到62.60 °T。由于乳酸菌在发酵过程中利用枸杞中的单糖、多糖等碳水化合物产生乳酸、乙酸等[15],这些有机酸既提高了枸杞发酵饮料的营养物质,又形成了枸杞发酵饮料的风味,还具有一定的抑菌效果,对枸杞发酵饮料的生产具有重要影响。

图6 发酵过程中可滴定酸的变化Fig.6 Changes of titratable acid during fermentation

2.2.4 发酵过程中还原糖的变化 枸杞液初始还原糖含量为2.790 mg/mL,发酵时间8 h内还原糖的含量变化趋势缓慢(如图7)。8 h后随着发酵的进行,枸杞液中的还原糖含量迅速降低,这可能是因为乳酸菌利用枸杞液中的单醣,转化为低分子的乳酸或乙酸。发酵28 h后,枸杞液中的还原糖降低到0.267 mg/mL,随后变化趋于平缓,说明还原糖已经基本被消耗。

图7 发酵过程中还原糖含量的变化Fig.7 Change of reducing sugar content during fermentation

2.2.5 发酵过程中可溶性固形物的变化 从图8可以看出,在0～8 h内枸杞发酵液中的可溶性固形物逐渐增加,这是由于发酵过程中枸杞中的内部物质溶出,使得可溶性固形物增多。在8～20 h中枸杞发酵液中的可溶性固形物快速减少,因为乳酸菌在繁殖过程中大量消耗碳水化合物。在20～32 h中枸杞发酵液中的可溶性固形物缓慢减少,这是因为乳酸菌的增殖进入平稳期。在32～40 h中枸杞发酵液中的可溶性固形物含量逐渐趋于平稳,这是因为乳酸菌的增殖进入衰退期。

图8 发酵过程中可溶性固形物的变化Fig.8 Changes of soluble solids during fermentation

2.2.6 发酵过程中可溶性蛋白含量的变化 在乳酸菌发酵枸杞液过程中,时间对发酵液中的可溶性蛋白含量有明显影响(如图9)。由图9可知,在0～24 h内枸杞发酵液中的可溶性蛋白含量明显增多,这是由于在发酵过程中,菌体会产生蛋白酶,在蛋白酶的作用下发酵液中的蛋白含量逐渐升高。发酵24 h后枸杞发酵液中蛋白含量迅速降低,这是由于可溶性蛋白会逐渐分解为具有多种香气的氨基酸,以维持乳酸菌自身的生长。

图9 发酵过程中可溶性蛋白质含量的变化Fig.9 Changes in soluble protein content during fermentation

2.3 发酵前后枸杞饮料中风味物质分析

香气成分是检测发酵饮料风味的主要指标，本实验使用GC-MS技术分离鉴定枸杞液发酵前后的挥发性成分。图10～图11分别为枸杞液发酵前后香气成分总离子流图，鉴定结果见表5。从表5可知,未发酵枸杞液中分析出32种成分,包括1种酯类、12种醛类、8种酮类、11种醇类共4类物质;发酵后的枸杞液中分析出63种化合物,主要的挥发物质包括12种酯类、16种醛类、15种酮类、13种醇类、4种酸类、芳香杂环类3种共6类物质。未发酵的枸杞液中,醇类、醛类、酮类物质相对含量高,对未发酵枸杞的风味贡献大。如壬醛有明显的油脂气味和甜橙气息,己醛具有天然的水果香气及青草、油脂气味。1-戊烯-3-醇、己醇、1-辛醇、1-壬醇、3-甲基-1-丁醇赋予枸杞一种令人愉快的气味,如1-戊烯-3-醇是存在于橙子、草莓、番茄等水果中的一种果香。酮类使未发酵枸杞饮料表现出独特的风味,如2,3-丁二酮会有浓郁的奶油香味。

图10 枸杞未发酵液的香气成分总离子流图Fig.10 Total ion currents of aroma components of unfermented beverage of Lycium barbarum

图11 枸杞发酵液的香气成分总离子流图Fig.11 Total ion currents of aroma components of fermented beverage of Lycium barbarum

表5 枸杞发酵前后挥发性物质GC-MS分析结果Table 5 GC-MS analysis of volatile components of Lycium barbarum before and after fermentation

续表

发酵后的枸杞液中,醇类、酯类物质相对含量较高。与发酵前相比,发酵后的枸杞液中,醇类物质种类和含量均有改变,正己醇成为枸杞发酵液的主要风味物质,具有果子香气。酯类物质含量明显增加,酯类物质具有成熟果香味或坚果味,对发酵液的整体风味具有促进作用,不同的酸和醇结合产生多种类具有不同香味的酯类,也是香气成分的主要组成。酮类、醛类物质相对含量明显下降,醛类是枸杞发酵液中的主要风味成分,给枸杞液带来独特的花香味。新增少量酸类、芳香杂环类物质,酸类物质可以使产品具有酸味感。呋喃类化合物具有水果香、焦糖香、烤香味,也是发酵产品的重要风味物质。

综合上述,经发酵后的枸杞挥发性化合物的种类明显增多,说明发酵过程中增加了枸杞发酵液的风味。

注：-代表在未发酵枸杞液中未检出。

3 结论

本研究通过单因素及正交实验优化实验研究了乳酸菌发酵枸杞的工艺,确定了选用保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌为菌种时的发酵工艺:接种量4%,料液比8∶1 g/100 mL、发酵时间24 h。该工艺下乳酸菌发酵枸杞过程中可滴定酸逐渐上升，pH及还原糖含量不断下降，活菌数、可溶性固形物含量、可溶性蛋白含量呈先升后降的趋势。通过发酵,产生了新的香气成分,枸杞发酵液中酯类成分明显增加,另外还发现了3种芳香杂环类物质,因此,枸杞发酵液中呈香物质的明显增多,可能是其风味更为独特的原因。

枸杞汁经乳酸菌发酵后其活菌数增加,风味大大改善,这类食品往往由一般的营养食品发展成为具有特殊效果的功能性食品,因而对其功能成分和风味物质的变化进行深入研究,对于增加枸杞果实的综合利用有重要意义。