酪蛋白酶解物的分离及其抗氧化活性

韩 娜,杨 敏,杨继涛,王元元,张 雪,王万超

(甘肃农业大学理学院,农业资源化学与应用研究所,甘肃兰州 730070)

酪蛋白是乳中一大类蛋白质的总称,又称干酪素,含量约为乳中蛋白质的80%[1]。酪蛋白含有人体必需的8种氨基酸,有着较高的营养价值和良好的功能特性,广泛应用于食品、化学和医药工业[2-4]。酪蛋白也是生物活性肽的良好来源,已从酪蛋白中分离得到多种生物活性肽,如阿片样肽、血管紧张素转化酶抑制肽、抗菌肽、免疫调节肽、磷酸肽等[5-11]。

近年来,众多学者研究了酪蛋白酶解物的分离及其抗氧化性。研究表明,酪蛋白的胃蛋白酶水解物分子量在913～2951 Da的肽段具有较好的自由基清除能力[12]。α-酪蛋白经高压、紫外辐照、远红外辐照处理后,DPPH自由基清除能力和还原力增强[13]。牦牛乳酪蛋白经中性蛋白酶和胰蛋白酶复合酶解后,产物抗氧化性最高[14]。羊乳酪蛋白的碱性蛋白酶水解物自由基清除力和亚铁螯合力较未酶解酪蛋白强[15]。中性蛋白酶酶解后,酪蛋白的DPPH清除活性最强[16]。由此可见,酪蛋白酶解后产生的肽段抗氧化活性强于未酶解酪蛋白。胃蛋白酶和胰蛋白酶是生物体内主要的蛋白水解酶,而酪蛋白的胃蛋白酶和胰蛋白酶连续水解物的抗氧化性研究鲜有报道。

众多学者分别采用超滤[17]、凝胶过滤色谱[18]、离子交换[19]、Sephadex G-15凝胶层析和DEAE-52树脂分离技术获得了具有高抗氧化活性的肽段[20],而且证明采用不同分离技术所得肽段的抗氧化性具有差异[19]。综上所述,酪蛋白酶解物不同片段具有不同抗氧化活性,高活性肽段的分离纯化是酪蛋白抗氧化性肽制备的关键,而不同树脂分离机理不同,因而所获得的酪蛋白肽的分子量、氨基酸组成、净电荷等均有差异,从而表现出不同的活性[21-22]。已有文献多采用阴离子交换树脂或大孔树脂对酪蛋白酶解物进行分离,而采用阳离子树脂分离的相关研究鲜有报道。

本论文采用胃蛋白酶和胰蛋白酶对牛乳酪蛋白进行连续水解,采用成本低廉的001阳离子交换树脂对酶解物进行分离,系统分析酪蛋白多肽的抗氧化性,获得具有较高抗氧化性的多肽,旨在为酪蛋白抗氧化肽的产业化开发寻求简单的分离工艺、廉价的分离材料。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

荷斯坦牛乳 兰州源生奶牛养殖专业合作社牛奶厂;001树脂阳离子交换树脂 上海汇珠树脂有限公司;透析袋(100～500 Da) 上海源叶生物科技有限公司;胃蛋白酶(10 U/mg)、胰蛋白酶(250 U/mg) 电泳纯,上海源叶生物科技有限公司;盐酸、磷酸二氢钠、氢氧化钠、十二烷基硫酸钠(SDS)、邻苯二甲醛(OPA)、四硼酸钠 天津市化学试剂三厂;赖氨酸、抗坏血酸 天津市光复精细化工研究所;大豆卵磷脂 郑州万博食品配料有限公司;2-硫代巴比妥酸、β-巯基乙醇、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、无水乙醇 天津医药化学有限公司;氯化亚铁、三氯乙酸、氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、三氯化铁 天津市凯信化学工业有限公司;铁氰化钾、菲洛嗪 天津市光复科技发展有限公司;2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚 萨恩化学技术有限公司;上述试剂均为分析纯。

3K-15高速冷冻离心机 德国Sigma公司;JJ224BC型电子天平 常熟市双杰测试仪器厂;PHS-3C pH计 上海三信仪器厂;恒温水浴磁力搅拌器 金坛市顺华仪器有限公司;TGL-16G台式离心机 上海安亭科学仪器厂;TU-1901双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;FD-1A-50冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司;FSJ-A03D1粉碎机 小熊电器股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酪蛋白的提取 参考杨敏等[23]的方法,将新鲜荷斯坦牛乳在高速冷冻离心机中离心15 min(温度4 ℃,转速6000 r/min),弃去上层脂肪,取其下清液逐滴加入1 mol/L的HCl,并且缓慢搅拌使其沉降,静置4 h后用纱布过滤,用蒸馏水洗涤沉淀4次,即得盐酸沉淀酪蛋白;将其置于冷冻干燥机中于-40 ℃冷冻干燥48 h。将干燥好的酪蛋白粉碎,装袋后置于冰箱4 ℃冷藏备用。

1.2.2 酪蛋白的水解

1.2.2.1 胃蛋白酶与胰蛋白酶先后连续水解制备酶解液(P+T) 准确称取1.0 g酪蛋白,加入30 mL蒸馏水溶解,45 ℃加热磁力搅拌,溶解过程中加1 mol/L HCl调节pH始终控制在2.0左右,直到酪蛋白溶解后用蒸馏水定容至50 mL。向酪蛋白溶液中加入300 μL质量浓度为0.1 g/mL的胃蛋白酶,在pH2.0的条件下恒温水浴37 ℃磁力搅拌3 h,酶解结束后在沸水浴中5 min灭酶活性,冷水中迅速冷却。然后用1 mol/L NaOH调节pH,控制在7.0左右,再加入400 μL质量浓度为0.1 g/mL的胰蛋白酶,在37 ℃ pH7.0的条件下磁力搅拌(2000 r/min)水解3 h,酶解结束后置于沸水浴5 min灭酶活性,冷水中迅速冷却。

1.2.2.2 胃蛋白酶酶解液(P)制备 准确称取1.0 g酪蛋白,加入30 mL蒸馏水溶解,45 ℃加热磁力搅拌,溶解过程中加1 mol/L HCl调节pH始终控制在2.0左右,直到酪蛋白溶解后，用蒸馏水定容至50 mL。向酪蛋白溶液中加入300 μL质量浓度为0.1 g/mL的胃蛋白酶,在pH2.0的条件下恒温水浴37 ℃磁力搅拌(2000 r/min)水解3 h,酶解结束后置于沸水浴5 min灭酶活性,冷水中迅速冷却。

1.2.2.3 胰蛋白酶水解液(T)制备 准确称取1.0 g酪蛋白,加入30 mL蒸馏水溶解,45 ℃加热磁力搅拌,溶解过程中加1 mol/L NaOH调节pH始终控制在7.0左右,直到酪蛋白溶解后，用蒸馏水定容至50 mL。向酪蛋白溶液中加入400 μL质量浓度为0.1 g/mL的胰蛋白酶,在37 ℃,pH7.0的条件下磁力搅拌(2000 r/min)水解3 h,酶解结束后置于沸水浴5 min灭酶活性,冷水中迅速冷却。

1.2.3 酪蛋白水解度的测定

1.2.3.1 赖氨酸标准曲线的绘制 OPA试剂的配制(现配现用):准确称取40 mg OPA溶于1.00 mL 95%乙醇溶液中,移取pH9.5的0.1 mol/L四硼酸钠缓冲溶液25.00 mL、20%(W/V)的SDS溶液2.50 mL、100 μLβ-巯基乙醇混合均匀,用蒸馏水定容至50 mL[24]。

称取赖氨酸0.0500 g,用蒸馏水定容至100 mL,配成浓度为500 μg/mL的溶液。分别移取适量赖氨酸溶液,稀释成对应浓度400、300、200、100、50 μg/mL。取上述赖氨酸溶液400 μL,用pH7.0的磷酸盐缓冲液稀释至7.5 mL;取上述溶液200 μL,加入6.00 mL OPA试剂,混合均匀后室温下暗室放置5 min,以200 μL蒸馏水和6.00 mL OPA试剂混合液为空白对照,测定340 nm下的吸光度;以赖氨酸浓度(c)作为横坐标,吸光度值作为纵坐标,绘制标准曲线[24]。

1.2.3.2 水解度的测定 取400 μL酪蛋白的胃蛋白酶(P)、胰蛋白酶(T)以及胃蛋白酶结合胰蛋白酶(P+T)酶解液或未加酶的酪蛋白溶液(20 mg/mL),用pH7.0的磷酸盐缓冲液稀释至7.5 mL;取200 μL上述酶解液,加入6.00 mL OPA试剂,混合均匀后室温下暗室放置5 min,以200 μL蒸馏水和6.00 mL OPA试剂混合液为空白对照,测定样品在340 nm下的吸光度。酪蛋白水解度公式[24]如下。

水解度(%)=[(A-A0)/A0]×100

式中:A0:未加酶样品的吸光值;A:酶解后样品的吸光值。

1.2.4 酪蛋白多肽的分离

1.2.4.1 离子交换树脂的预处理 饱和食盐水浸泡:称取250 g 001树脂置于烧杯中,倒入饱和食盐水,使饱和食盐水完全浸没树脂,并不断搅拌以除去气泡,使之充分混合,静置24 h。

水洗:将泡好的树脂装入分离柱中,用2倍柱体积的饱和食盐水缓慢冲洗树脂,然后用蒸馏水洗至无黄色液体流出。

碱洗:用5倍柱体积4%的NaOH溶液浸泡,再用蒸馏水冲洗至中性。

酸洗:用5倍柱体积4%的HCl浸泡,再用蒸馏水冲洗至中性。

1.2.4.2 多肽的分离 鉴于胃蛋白酶和胰蛋白酶共同酶解的程度较高,产生的多肽较多,因此本文只针对两种酶的共同酶解物(P+T)进行了分离。在室温条件下,将(P+T)酶解液50 mL流过001阳离子交换树脂层析柱,采用氯化钠梯度洗脱,氯化钠浓度为0～3%,洗脱液总体积为1500 mL,分管收集分离出的液体,每管收集15 mL,洗脱液用紫外-可见分光光度计在280 nm处测定吸光度。以体积为横坐标,洗脱液吸光度为纵坐标绘制洗脱曲线。

根据洗脱曲线,合并同一洗脱峰,置于透析袋(100～500 Da)中透析24 h,采用冷冻干燥机于-40 ℃冷冻干燥48 h,即得酪蛋白多肽。

1.2.5 抗氧化性测定

1.2.5.1 还原力的测定 参考Gu等[25]的方法,准确称取适量酪蛋白肽,用蒸馏水配制成1.0 mg/mL的溶液;将不同酶解液稀释至浓度为1.0 mg/mL,备用;分别取上述溶液1 mL,与1.0 mL 0.2 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH6.6)和1.0 mL 1%的铁氰化钾[K3Fe(CN)6]混合。将反应混合物在50 ℃水浴中温育20 min,冷却至室温后加入1.0 mL 10%三氯乙酸,混合液25 ℃ 4000 r/min离心10 min。取离心后上清液2.0 mL,加入2.0 mL蒸馏水和400 μL 0.1% FeCl3混匀。使用紫外-可见分光光度计在700 nm下测量反应混合物的吸光度。用700 nm处的吸光度表示还原力。

1.2.5.2 DPPH自由基清除活力的测定 参考Benjakul等[26]的方法,将2.0 mL 1.0 mg/mL的多肽溶液或酶解液加入到4.0 mL 0.1 mmol/L DPPH的乙醇溶液中。将溶液剧烈混合,并在室温下于黑暗中静置20 min。将混合物在4000 r/min下离心10 min。使用紫外-可见分光光度计在517 nm测量上清液的吸光度,记为A1;用等体积乙醇溶液替代DPPH溶液,吸光值记为A2,等体积水代替样品溶液,吸光值记为A0;等体积水和乙醇混合溶液调零。DPPH自由基清除力计算如下:

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

1.2.5.3 Fe2+螯合力的测定 将2.0 mL 浓度为1.0 mg/mL的多肽或酶解液与3.7 mL蒸馏水和0.1 mL浓度为2.0 mmol/L的FeCl2混合,将混合物在室温下静置30 s;加入0.2 mL浓度为5 mmol/L菲洛嗪并混合,在室温下静置10 min,于4000 r/min离心5 min;用紫外-可见分光光度计测定562 nm处的吸光度,记为A1。用水代替样品作为空白,以相同的方式进行测定,记为A2。Fe2+螯合力计算公式[25]如下:

螯合率(%)=(1-A1/A2)×100

1.2.5.4 脂质过氧化抑制力的测定 参考Yi等[27]的方法,将卵磷脂悬浮于磷酸盐缓冲液(0.01 mol/L,pH7.4)中,配制成浓度为10.0 mg/mL的溶液,标记为LLS。将15 g三氯乙酸(TCA)、0.37 g硫代巴比妥酸(TBA)和 2 mL浓HCl加入到蒸馏水中,将体积调节至100 mL,标记为TCA-TBA-HCl。将1 mL LLS、1.0 mL 400 μmol/L FeCl3、1.0 mL 400 μmol/L抗坏血酸和1.0 mL 1.0 mg/mL的多肽或酶解液依次混合。将溶液在37 ℃黑暗的水浴中放置60 min,再加入2.0 mL TCA-TBA-HCl。混合液在90～100 ℃水浴加热15 min后用冰水冷却。将溶液以750 r/min离心10 min,采用紫外-可见分光光度计于532 nm处测定上清液的吸光度,记为As。用1.0 mL蒸馏水替代样品,吸光度记为Ac。脂质过氧化抑制力按下式计算:

抑制力(%)=(Ac-As)/Ac×100

1.3 数据处理

各组数据均为3次实验的平均值±标准偏差,采用SPSS 18.0进行显著性分析,采用Origin 8.5作图。

2 结果与分析

2.1 酪蛋白水解度

赖氨酸标准曲线如图1所示。经线性拟合,得到赖氨酸标准曲线方程为y=0.00101x+0.03978,方程拟合度R2为0.9998,可以满足实验要求。

图1 赖氨酸标准曲线Fig.1 Standard curve of lysine

经标准曲线方程计算得知,酪蛋白的胃蛋白水解程度为60.64%±2.36%,酪蛋白胰蛋白酶的水解度为84.40%±1.70%,双酶连续水解程度为138.20%±5.74%。

2.2 酪蛋白多肽的分离

图2为(P+T)酪蛋白酶解液经001阳离子交换树脂分离的洗脱曲线。001阳离子交换树脂对(P+T)的分离效果较好,在30～90 mL处出现一个峰,标记为P1;在105～210 mL处出现第二个峰,标记为P2;在300～330 mL处出现第三个峰,标记为P3;在600～1110 mL处出现多个小峰,合并后标记为P4;在1200 mL之后出现的峰极小,弃去。

图2 酪蛋白(P+T)酶解液洗脱曲线Fig.2 Elution curve of casein enzymatic hydrolysate(P+T)

2.3 酪蛋白多肽的抗氧化活性

2.3.1 还原力 对分离获得的4种酪蛋白多肽和不同酶解液进行还原力测定,结果见图3。由图3可以看出,与分离所得的酪蛋白肽相比,P和(P+T)酶解液的还原力最低,且差异不显著(p>0.05);T的还原力约为0.026,是P和(P+T)两种酶解液的两倍;多肽P4的还原力最大,其还原力为0.165;P1略低于P4,为0.151;P2和P3的还原力差异不显著(p>0.05)。酪蛋白多肽的还原力顺序为P4>P1>P3>P2。(P+T)酶解液经过分离后获得的酪蛋白肽在相同浓度下还原力显著强于酶解液(p<0.05),可见经过001树脂分离,弃去了还原力较差的多肽,实现了还原力较高的多肽的富集。

图3 酪蛋白酶解液及多肽的还原力Fig.3 Reducing powers of casein enzymatic hydrolysate and peptides注:不同字母表示差异显著,p<0.05;图4～图6同。

多肽的抗氧化性是多种因素综合作用的结果,如氨基酸组成、氨基酸序列、分子量、空间结构等。酪蛋白酶解液成分复杂,不同酶的水解位点不同,酶解产生的多肽C端和N端氨基酸类型不同,致使不同酶解液的还原力不同。据报道,甲硫氨酸残基因含有硫原子而具有供电子能力,从而表现出较强的还原力;甘氨酸侧链上的氢原子使多肽具有较好的构象柔性;脯氨酸的吡咯烷环可以阻止多肽的α-螺旋结构生成,这些氨基酸的存在有利于多肽中其他氨基酸残基抗氧化性的发挥[28-31]。

2.3.2 DPPH自由基清除活力 对分离获得的4种酪蛋白多肽和不同酶解液进行DPPH自由基清除活力测定,结果见图4。由图4可以看出,几种酶解液中,P的DPPH自由基清除活性最高,且与其它酶解液差异显著(p<0.05);(P+T)酶解液的DPPH自由基清除活性最差。分离所得的4个肽段DPPH自由基清除活力较酶解液高。多肽P4的自由基清除率为19.03%±0.41%。P2和P3的自由基清除活性差异不显著(p>0.05)。

图4 酪蛋白酶解液及多肽的DPPH自由基清除力Fig.4 DPPH radical scavenging activity of casein enzymatic hydrolysate and peptides

DPPH法测定多肽的抗氧化性是基于单电子转移机理,评价的是多肽供电子能力,即还原性[32-33]。研究证明,组氨酸、半胱氨酸具有供电子能力,从而表现出自由基清除活性[34-35]。据此推断,P4中组氨酸和半胱氨酸百分含量可能较高。

2.3.3 Fe2+螯合能力 对(P+T)酶解液分离获得的4种酪蛋白多肽和不同酶解液进行Fe2+螯合力的测定,结果见图5。由图5可以看出,不同酪蛋白酶解液的Fe2+螯合力约为31%～33%,差异不显著(p>0.05)。经阳离子交换树脂分离所得的酪蛋白肽P1、P2、P3不具备Fe2+离子螯合能力,而P4的Fe2+螯合力为94.95%±0.07%。

图5 酪蛋白酶解液及多肽的Fe2+螯合力Fig.5 Fe2+ chelating activity of casein enzymatic hydrolysate and peptides

研究表明,组氨酸的咪唑基团可以螯合金属离子;酸性氨基酸如谷氨酸、天门冬氨酸带负电的侧链具有较好的金属螯合能力;碱性氨基酸赖氨酸也具有金属螯合能力[36]。胰蛋白酶的酶切位点为精氨酸和赖氨酸的羧基,从而使赖氨酸位于肽链的一端,有利于其金属螯合能力的发挥。赖氨酸含量较高的多肽具有较多的净电荷,在阳离子树脂上具有较好的吸附能力,采用高浓度的盐才能将其置换下来,所以洗脱峰越靠后,越有可能表现出金属螯合力,P4的出峰顺序证明了这一推断。另外,DPPH自由基清除能力测定结果显示,P4中组氨酸、半胱氨酸含量可能较高,而组氨酸具有较好的金属螯合能力,这是P4表现出极好地金属螯合能力的另一个可能原因,但是有待进一步证明。

2.3.4 脂质过氧化抑制力 3种(P+T、P、T)酶解液和4种酪蛋白多肽的脂质过氧化抑制力见图6。由图6可以看出,P表现出较好的脂质过氧化抑制力,抑制率为51.78%±0.06%;T的脂质过氧化抑制力为14.83%±0.12%;(P+T)酶解液的抑制力极低,为0.39%±0.0029%。就多肽而言,仅有P4具有极低的抑制力,为0.89%±0.0067%,可忽略。

图6 酪蛋白酶解液及多肽的脂质过氧化抑制力Fig.6 Inhibition on lipid peroxidation of casein enzymatic hydrolysate and peptides

疏水性氨基酸具有较好的脂溶特性,如亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸等,从而易表现出较好的脂质过氧化抑制能力[37-38]。胃蛋白酶的酶切位点为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸残基,使其位于多肽链的一端,因而表现出较好的脂质过氧化抑制力。当上述多肽再次被胰蛋白酶酶切后,多肽分子量和氨基酸组成均发生了很大变化,且其亲水性增强,所以抑制力降低。虽然P4表现出较好地还原力、DPPH自由基清除力和金属螯合力,但因其亲水性较强,所以脂质过氧化抑制力极弱。

3 结论

以牛乳酪蛋白为原料,经胃蛋白酶和胰蛋白酶连续水解后通过001阳离子交换树脂分离,获得4个肽段,分离效果较好。对酪蛋白的胃蛋白酶酶解液、胰蛋白酶酶解液、胃蛋白酶+胰蛋白酶连续酶解液和分离所得的4个肽段分别进行抗氧化性研究发现,分离所得酪蛋白肽的还原力和DPPH自由基清除能力远高于3种酶解液。就Fe2+螯合力而言,混合多肽P4表现出极高的Fe2+螯合能力,螯合率高达94.95%,3种酶解液的Fe2+螯合能力相当,而酪蛋白肽P1、P2、P3不具备Fe2+螯合能力。在脂质过氧化抑制方面,酪蛋白的胃蛋白酶酶解液表现出较好的抑制力,其次为胰蛋白酶酶解液,多肽及胃蛋白酶+胰蛋白酶连续酶解液几乎不具有脂质过氧化抑制力。