基于雌激素受体探讨梓醇对抗糖剥夺心肌细胞损伤的作用

王素云，卢 颖，蔡丹凤，童 静，成 鹏，余夕潮，李 育，卞慧敏

(南京中医药大学 1. 药学院、2. 江苏省中药药效与安全性评价重点实验室、3. 医学与生命科学学院，江苏 南京 210023)

近年来研究表明，心肌细胞在缺血缺氧状态下，线粒体内会产生大量氧自由基，氧自由基生成及脂质过氧化反应增强是心肌损伤的主要机制之一[1]，积累的活性氧(reactive oxygen species,ROS)可损伤线粒体。因此，适时地清除老化和发生损伤的线粒体对于细胞的正常生长具有非常重要的作用[2]。研究发现，自噬可以用来清除受损的细胞器，在自由基的刺激下，可被特异性的自噬过程降解，从而减少细胞氧化损伤[3-4]，因此，细胞通过基础水平的自噬以维持胞质内线粒体的更新。现代药理研究证实，梓醇(catalpol)是地黄中发挥药理作用的主要活性成分之一，梓醇具有神经保护、抗炎的作用，能提高脑缺血/再灌注动物模型的学习记忆能力，抑制细胞凋亡，减少神经元死亡等[5-6]，但是梓醇对于心血管系统保护作用研究尚处于起步阶段。前期研究中，利用分子对接技术，对地黄中单体进行雌激素受体(estrogen receptor, ER)调节剂筛选时，发现梓醇与ERα、ERβ结合率较高，但是对于梓醇能否通过ER介导细胞自噬，抑制心肌损伤尚不明确。故本研究利用糖剥夺心肌细胞氧化损伤模型，探讨梓醇对心肌细胞的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞株 大鼠心肌细胞株H9c2，购自上海拜力生物科技有限公司。

1.1.2试剂 梓醇(货号：L26D6Y8111)，购自上海源叶生物科技公司；胎牛血清(货号：1619679)、DMEM培养基(货号：C11995500BT)、无糖培养基(货号：1710161)，均购自Gibco公司；LC3抗体(货号：66139-1-1g)，购自CST公司；Beclin-1抗体(货号：1306-1-AP，Proteintech公司)；p62(货号：ab91526)、Parkin(货号：ab15954)、PINK1(货号：ab23707)抗体、ERα抗体(货号：ab32063)，ERβ抗体(货号：ab92306)，均购自美国Abcam公司；雌激素受体α抑制剂(MPP)(货号：072M4702V)、雌激素受体β抑制剂(PHTPP)(货号：065M4603V)，均购自sigma公司；活性氧(ROS)试剂盒(货号：S0033)，购自上海碧云天生物技术有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(货号：A001-1)、丙二醛(MDA)试剂盒(货号：A003-1)，均购自南京建成生物工程研究所；siNTC(货号：Y007)、siERα(货号：Y3512)，购自上海和元生物技术有限公司。

1.1.3仪器 Synergy2酶标仪(Bio-Tek公司)；荧光倒置显微镜(ZEISS公司)；5417R低温超速离心机(Eppendorf公司)；蛋白电泳、转移设备(Bio-Rad公司)；自动曝光仪(Bio-Rad公司)。

1.2 细胞培养与分组H9c2心肌细胞于用含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，于37 ℃、5% CO2、100%饱和湿度培养，当细胞融合达80% ～ 90%时，用胰蛋白酶消化，并用培养基配成细胞悬液，6孔板每孔铺 1×106 cells/mL，待细胞长至70%时，吸去细胞上清，加入含药培养基。雌激素抑制剂实验将细胞分为 5 组：对照组、模型组、梓醇(28 μmol·L-1)+MPP(10 μmol·L-1)组、梓醇(28 μmol·L-1)+THTPP(10 μmol·L-1)组。慢病毒转染实验将细胞分为 7组：对照组、模型组、梓醇(28 μmol·L-1)、siNTC组、siNTC+梓醇组(28 μmol·L-1)、siERα组、siERα组+梓醇组(28 μmol·L-1)。以上均为药物终浓度。于5% CO2、37℃下培养24 h后，糖剥夺6 h对细胞进行无糖饥饿处理，空白对照用正常培养基培养。

1.3 MTT法检测H9c2细胞存活率待细胞长至70%时，吸去细胞上清，加入含药培养基。细胞分为对照组、不同浓度梓醇组(终浓度0.28、2.8、28、280、2 800 μmol·L-1)。于5% CO2、37 ℃培养24 h。24 h后，吸去细胞上清，PBS缓冲液洗涤3次，每孔加入完全培养基180 μL及MTT 20 μL，避光，37 ℃ 孵育4 h，每孔加150 μL DMSO溶解孔内结晶物，避光，摇床上振荡15 min，于酶标仪490 nm下测吸光度(OD)值。

1.4 H9c2细胞ROS、MDA、SOD活力的检测取出经糖剥夺6 h及药物作用24 h后的心肌细胞，按照ROS、MDA、SOD试剂盒说明书检测。

1.5 电镜观察收集细胞，离心，经2.5%戊二醛固定后送检，透射电子显微镜观察细胞中自噬小体的结构。

1.6 Western blot检测自噬蛋白表达待细胞长至70%时，吸去细胞上清，PBS洗3次，将细胞分为空白对照组、模型组、梓醇(0.28、2.8、28 μmol·L-1)组。于5% CO2、37 ℃培养24 h后，糖剥夺6 h对细胞进行无糖饥饿处理，细胞裂解液裂解细胞，离心后，上清用BCA法测定蛋白浓度，蛋白定量60 μg，煮沸5 min，上样于10% SDS-PAGE胶，电泳1.5 h，全湿式电转将蛋白转移到PVDF膜上。室温下用含5%脱脂奶粉封闭1 h。加入一抗(1 ∶1 000)、二抗(1 ∶1 000)，化学发光检测目的条带，在凝胶成像系统上观察分析并拍照。用目的蛋白与内参蛋白的灰度值之比计算蛋白表达水平。

1.7 慢病毒转染胰酶消化H9c2细胞配成细胞悬液，6孔板每孔铺2×105cells/mL，24 h后汇合度30%左右(分组同“1.2”)，感染病毒siNTC和siERα，加polybrene，感染20 h后弃去培养基，每孔加入2 mL新鲜的培养基。感染72 h后，吸去细胞上清，加入含药培养基，于5% CO2、37 ℃培养24 h后，糖剥夺6 h对细胞进行无糖饥饿处理，空白对照依然用正常培养基培养。

2 结果

2.1 梓醇对糖剥夺诱导的H9c2心肌细胞氧化损伤的影响细胞毒性实验结果表明(Fig 1A)，当梓醇终浓度超过280 μmol·L-1时，出现明显抑制细胞生长的作用。0.28、2.8、28 μmol·L-1的梓醇对糖剥夺诱导H9c2损伤均有保护作用(Fig 1B)，且呈剂量依赖性。糖剥夺后ROS的水平明显升高(Fig 1C)，MDA含量明显升高，SOD活性明显降低(Fig 1D、1E)；给予梓醇处理后，能明显降低心肌ROS的水平和MDA含量，升高SOD活性，且呈剂量依赖性。电镜观察显示(Fig 1F)，与空白对照组比，糖剥夺组作用后能观察到肿胀破损的线粒体；与糖剥夺组比，给予梓醇干预后出现明显的自噬小体，典型的自噬小体中还可看到包含破损的线粒体。

Fig 1 Effect of catalpol on oxidative damage of H9c2 cells induced by glucose n=6)

A: Survival rate of H9c2 cardiomyocytes; B: Protective effect of catalpol on H9c2; C: Release of ROS; D and E: Release of MDA and SOD; F: Electron microscopic observation results. Arrows indicate autophagosome.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

2.2 梓醇对糖剥夺诱导的H9c2细胞中ER的影响Fig 2结果表明，与空白对照组相比，糖剥夺组ERα、ERβ表达明显降低；不同浓度梓醇处理后，H9c2细胞中ERα、ERβ蛋白表达均升高，表明梓醇能提高受损心肌细胞的ER蛋白的表达量。

2.3 梓醇对糖剥夺诱导的H9c2细胞氧化损伤的保护作用是通过ERα介导的实验结果表明(Fig 3A、3B)，梓醇能够明显增加SOD活性，降低MDA含量，加入MPP(ERα抑制剂)能明显逆转梓醇的作用(P<0.01)，而PHTPP(ERβ抑制剂)却不能阻断梓醇的作用。同时，MPP也能明显逆转梓醇对自噬相关蛋白Beclin-1、LC3(Fig 3C、3D)，以及线粒体自噬相关蛋白Parkin、p62、PINK1(Fig 3E、3F)的调节作用(P<0.01)，同样PHTPP却没有这种逆转作用。说明ER介导的梓醇抗氧化、上调自噬的作用与ERα密切相关。

Fig 2 Effects of catalpol on estrogen receptors in H9c2 cells induced by glucose deprivation n=3)

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

2.4 siRNA ERα后梓醇对糖剥夺H9c2细胞自噬的影响为了进一步验证ERα与自噬及线粒体自噬的关系，用慢病毒转染H9c2细胞干扰ERα表达。免疫荧光及Western blot鉴定ERα转染结果表明(Fig 4A、4B)，当MOI值达到60时，免疫荧光转染率达到近80%，ERα表达明显减少。慢病毒干扰ERα后，观察梓醇对氧化损伤的影响，结果表明(Fig 4C、4D)，与SiNTC+catalpol相比，siERα干扰后给予梓醇能部分降低MDA含量，增加SOD的含量，抗氧化作用被部分逆转。Western blot实验结果表明(Fig 4E、4F)，与SiNTC+catalpol相比，siERα干扰后能部分逆转梓醇上调Beclin-1、LC3、Parkin表达，下调p62、PINK1表达的作用，说明ERα介导了梓醇调节自噬及线粒体自噬对抗糖剥夺诱导的心肌损伤。

3 讨论

心肌缺血将造成心肌缺血供氧不足，不仅易引发心绞痛、冠心病、心衰等，甚至可能导致死亡。心肌细胞属于终末细胞系，缺乏再生能力，减少心肌损伤以及修复损伤后的心肌细胞尤为重要。线粒体是机体内源性自由基产生的主要部位，而损伤和功能失调的线粒体可产生大量的ROS，超出正常水平的ROS诱导氧化应激会损害细胞，导致线粒体损伤及膜电位的降低[7]，进一步加重心肌缺血。本实验结果表明，给予梓醇处理后可降低心肌细胞氧化损伤，有效清除自由基，并且能明显降低MDA含量，升高SOD活性，起到保护心肌细胞的作用。

在心肌细胞中，抗霉素A(antimycin A,AMA)通过增加线粒体超氧化物产生，减少线粒体膜势能及减少细胞内呼吸作用，促进心肌细胞损伤，而雷帕霉素通过mTOR途径诱导自噬，提高线粒体功能，促进受损线粒体清除，保护心肌细胞免受AMA的毒害作用[8]。此外，在酵母中,当基因突变使线粒体无法维持跨膜电势时，线粒体自噬水平明显上调，损伤线粒体被特异性地清除[9]。多种心血管疾病(如心肌病、心脏缺血/再灌注损伤、心功能不全等)的存在心肌细胞自噬现象[10]。我们的实验结果也证实，梓醇能有效促进自噬小体的形成，明显增加自噬相关蛋白Beclin-1及LC3的蛋白表达，并能增加线粒体自噬相关蛋白表达，降低MDA水平，说明梓醇能通过增强糖剥夺诱导的心肌损伤中自噬水平，减轻氧化损伤，保护心肌细胞。

研究发现，植物雌激素能够促进自噬的发生[11-12]。在心肌肥厚模型中给予葛根素治疗，可明显上调自噬标志性蛋白LC3表达，并在体外培养的H9c2细胞中呈现浓度依赖的特点[13]。Duan等[14]研究发现，白藜芦醇可以通过激活SIRT3/AMPK信号转导通路，促进线粒体自噬，修复巨噬细胞氧化损伤；也可以上调缺血皮质区脑组织LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达，发挥对缺血/再灌注大鼠神经元的保护作用。因此推测，植物雌激素对自噬的调控是通过ER介导的。本实验表明当ERα被抑制后，自噬及线粒体自噬也被抑制。梓醇能有效调节ERα的表达，进而促进自噬与线粒体自噬，发挥对糖剥夺诱导心肌损伤的保护作用。

综上所述，梓醇上调自噬发挥对心肌损伤保护的作用是由ERα调控的。本研究有助于揭示植物雌激素样成分可通过ERα促进自噬及线粒体自噬，为揭示植物雌激素样成分抗心肌损伤的科学内涵提供依据。

Fig 3 Effect of catalpol on oxidative damage autophagy induced by glucose deprivation in H9C2 cells after ERα and ERβ blockade

A and B: Release of MDA and SOD (n=6); C and D: Western blot results and the quantitative data of Beclin-1 and LC3(n=3); E and F: Western blot results and the quantitative data of p62, Parkin and PINK1 (n=3).*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group;▲P<0.05,▲▲P<0.01vscatalpol group.

Fig 4 Effect of catalpol on glucoside deprivation H9c2 autophagy after siRNA ERα

A: Identification of siERα fluorescence in H9c2 cells; B: Western blot verified the successful ERα transfection (n=3); C and D: Release of MDA and SOD (n=6); E and F: Western blot results and quantitative data (n=3). 1:Control;2:Model; 3: catalpol;4:siNTC;5: siNTC+catalpol;6: siERα;7: siERα+ catalpol.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group;△P<0.05vssiNTC+ catalpol group.

(致谢：本课题在江苏省中药药效与安全性评价重点实验室完成，特别感谢实验的指导老师及各位参与者！)