长链非编码RNA-HOTAIR对胃癌SGC-7901细胞增殖凋亡的影响及可能机制

吴谢慧 赖铭裕 姜丹 张田宇 蒋丽萍 方子良 梁海秋

广西医科大学第一附属医院老年消化内科（南宁530021）

胃癌是全球最常见的消化道恶性肿瘤之一。据统计，我国2014年新发病例约40 万例，占世界总发病例数的42%［1］。因此，阐明胃癌的发病机制在胃癌预防、早期诊断及治疗策略中有着举足轻重的作用。

近年来研究表明长链非编码RNA（long nonprotein codingRNA，LncRNA）与多种肿瘤的发生、发展有关［2-4］。其中，HOTAIR 在多种肿瘤中有异常表达，并且其表达量与肿瘤的转移、进展及预后相关［5］，提示HOTAIR 可能成为肿瘤诊断有力的预测指标及治疗靶点。为了探讨HOTAIR 在胃癌发生发展中的关系，本研究通过对胃癌SGC-7901细胞进行转染，探讨HOTAIR 表达量对胃癌SGC-7901 细胞增殖凋亡的影响，并通过qRT-PCR 检测细胞的微小非编码RNA-126（microRNA 126，miR-126）表达量，探讨HOTAIR 影响胃癌发生发展的可能机制，为后续研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 人胃癌SGC-7901 细胞株购于中国科学院细胞库；胰酶及胎牛血清（FBS）购自Gibco 公司；RPMI-1640 及DMEM 培养基购于Hy-Clone 公司；HOTAIR 过表达质粒、慢病毒与小干扰HOTAIR（si-HOTAIR）质粒由镇江爱必梦生物科技有限公司构建合成；CCK-8 试剂盒、Annexin VFITC 细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物公司；LipofectamineTM2000 Transfection Reagent 试剂购自invitrogen 公司；慢病毒滴度检测试剂盒购自镇江爱必梦生物科技有限公司。

1.2 细胞培养及实验分组 将体外培养的人胃癌细胞株SGC-7901 分为：空白对照组即Blank 组（单纯的SGC7901 细胞株）；HOTAIR 过表达组（转染HOTAIR 过表达质粒）；si-HOTAIR 组：（转染si-HOTAIR 质粒）。培养条件：37 ℃，5%CO2恒温细胞培养箱，HOTAIR 过表达组培养基为RPMI +10%FBS+1%P/S+400 μg/mL G418，si-HOTAIR 组培养基为RPMI+10%FBS+1%P/S+0.2 μg/mL Puromycin，Blank 组培养基为RPMI+10%FBS+1%P/S。

1.3 细胞株构建

1.3.1 构建lncRNA-HOTAIR稳定过表达细胞株HOTAIR 过表达质粒信息为：pLenti-GIII-CMV-GFP-2A-Neo Vector。HOTAIR 正向引物序列 为：5′-ACATTCTGCCCTGATTTCC-3′，反向引物序列为：5′-AGTGCCTGGTGCTCTCTTAC-3′；无血清培养基中加入pLenti-GIII-CMV-GFP-2A-Neo Vector 表达质粒和慢病毒转染辅助质粒2nd Generation Packaging Mix。将Lentifectin 与无血清培养基的混合溶液加入到质粒混合溶液中，得到DNA/LentiFectin 混合物。48 h 后收集浓缩的病毒颗粒并包装细胞。最后确定HOTAIR 过表达细胞株的药筛浓度为400 μg/mL。

1.3.2 构建si-HOTAIR 细胞株 si-HOTAIR 质粒信息为：piLenti-siRNA-GF。无血清培养基中加入pilenti-siRNA-GFP Vector 表达质粒和慢病毒转染辅助质粒2nd Generation Packaging Mix。将Lentifectin 与无血清培养基的混合溶液加入到质粒混合溶液中，得到DNA/LentiFectin 混合物。48 h 后收集浓缩的病毒颗粒包装细胞。最后确定si-HOTAIR 细胞株的药筛浓度为0.2 μg/mL。

1.4 实时定量荧光PCR（RT-qPCR） 提取细胞总RNA，用分光光度计检测RNA 的浓度和质量。将RNA 逆转录为cDNA，加入引物及内参GAPDH等，置于7300 HT 荧光定量PCR 仪进行扩增。反应条件为95 ℃预变性30 s，1 个循环；PCR 反应95 ℃变性5 s，60 ℃退火20 s，70 ℃延伸30 s，40 个循环。采用2-△△Ct法计算miR-126 的相对表达量。

1.5 CCK8 实验 96 孔板中每孔加入100 μL 密度为5 × 104/mL 细胞悬液，37 ℃、5%CO2细胞培养箱中下培养7 d，每天固定时间对各组细胞分别进行酶标仪检测，读取数值前对各组细胞更换新鲜培养基，并在每孔中加入10 μL CCK-8 溶液；在37 ℃、5%CO2细胞培养箱内继续孵育2 h。OD450测定吸光值并保存数值。

1.6 平板克隆形成实验 每组设置3 个培养皿，每皿约种100 个细胞，在37 ℃、5%CO2细胞培养箱内继续培养，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时终止培养。用PBS 浸洗后加入5 mL 4%多聚甲醛固定20 min，然后用结晶紫染色，清洗染液后晾干拍照。计数每个培养孔内形成的克隆。克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%。

1.7 流式细胞术 将各细胞按照5 × 105细胞/孔的密度铺6 孔板，每组设置3 个复孔，待第二天细胞生长至对数生长期时收集细胞并计数。取5 ～10 × 104细胞，离心后加入195 μL Annexin V-FITC结合液重悬细胞。加入5μL Annexin V-FITC、10 μL 碘化丙啶染色液混匀。室温条件下避光孵育10 ～20 min，随后将其置于冰浴中。在1 h 之内完成检测。

1.8 Caspase3/7 活性检测 每组设置3 个复孔，每孔加入约5 000 个细胞。培养24 h 后，将Caspase-Glo3/7 底物和缓冲液混合，取100 μL 混合液加入孔中，混合孵育1 h 后酶标仪测波长405 nm 处的吸光值，计算处理组吸光度与对照组吸光度的比值，确定活化程度。

1.9 统计学方法 采用SPSS 17.0 统计软件进行统计分析。各组实验数据均用表示，两组间比较采用t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实时荧光定量PCR 检测各组细胞HOTAIR的表达情况 如图1所示，HOTAIR 过表达组的胃癌细胞较Blank 组细胞中HOTAIR 表达量显著上升；而si-HOTAIR 组的胃癌细胞较Blank 组细胞中HOTAIR 表达量下降，两组间差异均有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 HOTAIR 对胃癌SGC-7901 细胞增殖能力的影响 CCK8 结果见图2。第1 天到第7 天HOTAIR过表达组与Blank 组的细胞增殖情况比较的P值分 别 为0.199、0.360、0.042、0.040、0.001、0.028、0.012，从第3 天开始两组间差异有统计学意义（P＜0.05），过表达组的细胞增殖水平高于空白对照组。另一方面，si-HOTAIR组与Blank组的细胞增殖情况比较的P值为0.000、0.003、0.000、0.002、0.001、0.004、0.002，从第1 天开始，两组间差异有统计学意义（P＜0.05），si-HOTAIR 组的细胞增殖水平明显低于Blank组。

图1 qRT-PCR 检测各组细胞HOTAIR 表达量Fig.1 The expression of HOTAIR in cells was detected by qRT-PCR

图2 CCK8 法检测各组细胞增殖能力Fig.2 Proliferation avtivities of cells in various groups detected by CCK8 method

平板克隆形成实验结果见图3。HOTAIR 过表达组的克隆形成率分别为56.0%，46.3%，53.3%；与之对照的Blank 组的克隆形成率分别为31.8%，35.0%，36.9%。HOTAIR 过表达组细胞克隆形成率高于Blank 组，两组间差异具有统计学意义（P＜0.006）。si-HOTAIR 组克隆形成率分别为22.8%，25.2%，27.6%；与之对照的Blank 组克隆形成率分别为34.0%，41.8%，48.9%。si-HOTAIR 组细胞克隆形成率低于Blank 组，两组间差异具有统计学意义（P=0.022）。

图3 平板克隆形成实验检测各组细胞增殖生长能力Fig.3 Proliferation avtivities of cells in various groups detected by colony formation assay

2.3 HOTAIR 对胃癌SGC-7901 细胞凋亡的影响 流式细胞术结果见图4，过表达组中细胞的凋亡率分别为2.53%，1.51%，2.54%，与之进行对照的Blank组的凋亡率分别为5.65%，5.18%，4.54%，HOTAIR 过表达组的凋亡率较低于Blank 组，两组间差异具有统计学意义（P=0.003）；另一方面，si-HOTAIR 组的凋亡率分别为14.88%，15.02%，19.22%，与之对照的Blank组的凋亡率分别为5.11%，5.19%，4.66%，si-HOTAIR 组的凋亡率明显高于Blank组，两组间差异具有统计学意义（P=0.01）。

图4 流式细胞术检测各组细胞凋亡情况Fig.4 Apoptosis effects of cells in various groups detected by flow cytometry

Caspase3/7 活性实验结果见图5，HOTAIR 过表达组的荧光光强明显弱于Blank 组，即过表达组的凋亡率低于Blank 组；si-HOTAIR 组的荧光光强明显强于Blank 组，即HOTAIR 过表达时抑制细胞凋亡，而HOTAIR 沉默时细胞凋亡被促进。

2.4 实时荧光定量PCR 检测各组细胞miR-126 的表达情况 如图6所示，HOTAIR 过表达组细胞的miR-126 表达水平较Blank 组细胞降低，两组间差异有统计学意义（P＜0.05）；而si-HOTAIR组细胞的miR-126 表达水平较Blank 组细胞显著增高，两组差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

长链非编码RNA 是一类长度大于200 bp 的非编码RNA，在多种生物进程中均发挥重要的作用［6-7］，HOX 转录反义RNA（HOTAIR），是第一个被发现具有反式转录调控作用的长链非编码RNA，长约2 158 nt，位于哺乳动物基因组12q13 上HOXC位点［5］。GUPT 等［8］发现，HOTAIR 可参与染色质的修饰，靶向结合多梳状抑制性复合体2（polycomb repressive complex 2，PRC2），将其募集到HOXC位点，导致H3 组蛋白第27 位赖氨酸（histone H3 lysine K27，H3K27）三甲基化和HOXC 位点表观遗传沉默。

图5 Caspase3/7 实验检测各组细胞凋亡情况Fig.5 Apoptosis effects of cells in various groups detected by Caspase3/7 assay

图6 qRT-PCR 检测各组细胞miR-126 表达量Fig.6 The expression of miR-126 in cells was detected by qRT-PCR

在乳腺癌中，HOTAIR 在乳腺癌原发灶及转移灶中存在高表达，并且其在原发灶的高表达量与患者的无转移生存率及总体生存率下降有关［8］。GENG 等［9］发现，与癌旁组织相比，肝癌组织中的HOTAIR 表达量明显升高，肿瘤中HOTAIR 高表达的患者在肝切除术后复发的风险增加。HOTAIR表达与淋巴结转移之间也存在显着相关性。HOTAIR基因敲除后，肝癌细胞增殖被抑制，基质金属蛋白酶-9（matrix metalloprotein 9，MMP-9）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）蛋白水平降低，HOTAIR 可能是肝癌淋巴结转移的潜在标志物［9］。

PADUA 等［10］发现，HOTAIR 在胃癌组织中的表达水平高于配对癌旁组织，并且在胃癌患者血浆中的水平也高于健康对照者。血浆中HOTAIR水平与癌组织HOTAIR 水平呈正相关，且HOTAIR高表达可促进胃癌的淋巴结转移、血管侵犯及EMT 进展［10-11］，提示HOTAIR 过表达是胃癌预后差的标志物。除此之外，HOTAIR 还在结直肠癌、胰腺癌等肿瘤中存在异常表达，并且在这些肿瘤的增殖及迁移中起重要作用［12-14］。

本实验通过对胃癌SGC-7901 细胞进行转染使其表达不同HOTAIR 水平，分别与Blank 组进行对照，验证了胃癌细胞中HOTAIR 过表达时促进胃癌SGC-7901 细胞的增殖并抑制其凋亡；当HOTAIR 基因被沉默后，胃癌细胞增殖也被抑制，而细胞凋亡率上升。

有研究报道，在人神经胶质瘤中，HOTAIR 与微小非编码RNA 126-5p（miR-126-5p）有潜在结合位点，HOTAIR 可能作为竞争性内源RNA（ceRNA）通过互补序列下调miR-126，从而影响神经胶质瘤的进展［15］。也有研究报道，HOTAIR 可能通过ceRNA 竞争性结合miR-126 从而激活下游PI3K/AKT/MRP1 通路，影响胃癌对顺铂的耐药性［16］。本研究发现胃癌SGC-7901 细胞中miRNA-126 的表达与HOTAIR 的表达水平呈负相关，猜测HOTAIR 可能通过相似机制调节miR-126，从而影响胃癌细胞的增殖及凋亡，本文仅从qRT-PCR 方面探讨其可能性，下一步将采用双荧光素酶实验检测HOTAIR与miR-126 结合位点、改变miR-126 表达量等方法继续研究其具体机制。

综上所述，HOTAIR 能够促进胃癌细胞的增殖，并抑制其凋亡，其机制可能与miR-126 的表达量有关。本研究为胃癌的治疗及预后提供了新的靶点及突破口。