PTEN-Long对人脑胶质瘤U251细胞增殖、侵袭及凋亡的影响

耿连婷 郑克彬 李春晖 张新婷 曾昭穆 张欣

1河北大学附属医院神经外科（河北保定071000）；2石家庄市第四医院医疗美容科（石家庄050000）；3河北大学医学院（河北保定071000）

胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤［1］，其发病机制尚不明了［2］，手术和放化疗效果有时并不理想，目前基因治疗越来越受到重视。第10 号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因（phosohatase and tensin homolgue deleted on chromosome 10，PTEN）是重要的抑癌基因［3-4］，PTEN-Long 是PTEN的一种翻译变体［5］，与其具有相似的磷酸酶活性。PTEN-Long 还具有特殊的细胞分泌和穿透作用［5］，在基因治疗中增加了蛋白治疗的可能性，避免了免疫原性风险［6］。PTEN-Long 可抑制PI3KAKT 通路活性，此通路影响肿瘤增殖的多个关键步骤，核转录因子κB（nuclear factor kappa-B，NFκB）影响细胞存活及凋亡，其异常激活和恶性肿瘤的发生密切相关［7］，目前对PTEN-Long 影响下游NF-κB 的研究相对较少。本研究通过构建PTENLong 过表达模型，探讨PTEN-Long 对U251 细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡的影响及与PI3K-AKT-NF-κB信号通路的关系，为基因治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人胶质瘤细胞U251 购自国家实验细胞资源共享服务平台北京总部，PTEN-Long 过表达载体质粒构建和慢病毒包装由赛业公司完成。慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。质粒组成中包含目的基因hPTEN［NM_001304717.2］*/3xFLAG、EGFP：T2A：Puro 和氨苄西林抗性基因。表达载体和包装质粒共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。胎牛血清、DMEM 培养基购自Gibco 公司；基因检测引物由Invitrogen 公司合成；逆转录试剂盒、实时荧光定量试剂盒购自TaKaRa 公司；兔抗人β-Actin、辣根过氧化酶标记羊抗兔抗体购自Affinity 公司；兔抗人AKT1/2/3、p-Akt 抗体购自Abways 公司；兔抗人IκBα单抗购自Abcam 公司；兔抗人PTEN、NF-κB p65、p-NF-κB p65、bcl-xl 单抗购自CST 公司；CCK-8 试剂盒购自DOJINDO 公司；基底胶购自Solarbio 公司。实验经河北大学医学综合实验中心动物伦理委员批准（伦理批准号：2018015）。

1.2 细胞培养及转染 U251 细胞在含10% FBS、1%青链霉素的DMEM 培养基，37 ℃，5%CO2，饱和湿度环境的条件下连续培养。实验分3 组：（1）未感染慢病毒的U251 为对照组；（2）感染LV-EGFP的U251 为空载组；（3）感染LV-PTEN-Long-EGFP的U251 为过表达组。取对数期细胞接种至12 孔板（1×105个/孔），24 h 后观察细胞密度，汇合度在80%为宜。更换新鲜培养基，加入慢病毒质粒载体，使感染复数（multiplicity of infection，MOI）值为50，加入Polybrene 溶液（5 μg/mL）。6～12 h 后观察细胞形态并更换新鲜培养基，72 h 后于荧光显微镜下观察绿色荧光，若转染效率为80%以上，嘌呤霉素（1.5 μg/mL）筛选3 d。

1.3 RT-PCR 检测目的基因的mRNA 表达水平Trizol 法提取细胞总RNA，根据试剂盒说明书制备cDNA 及RT-PCR 扩增。PTEN-Long 基因上游引物5′-CTCCAAATTTTAAGGTGAAGCTGT-3′，下游引物5′-CTCTGGATCAGAGTCAGTGGT-3′；PTEN 基因上游引物5′-CAGAAAGACTTGAAGGCGTAT-3′，下游引物5′-AACGGCTGAGGGAACTC-3′；AKT 基因上游引物5′-GCAGCACGTATACGAGAAGA-3′，下游引物5′-GGTGTCAGTCTCCGACGTG-3′；NF-κB p65基因上游引物5′-GAGGACTGCTGCTACGTCAC-3′，下游引物5′-ACCAGGTTCAGGTTCAGCTC-3′；IκBα基因上游引物5′-AACCTGCAGCAGACTCCACT-3′，下游引物5′-ACACCAGGTCAGGATTTTGC-3′；bcl-xl基因上游引物5′-GTAAACTGGGGTCGCATTGT-3′，下游引物5′-TGCTGCATTGTTCCCAT AGA-3′；β-Actin 基因上游引物5′-CATCCCCCAAAGTTCACAAT-3′，下游引物5′-AGTGGGGTGGCTTTTAGGAT-3′。使用Applied Biosystems 7300 Fast Real-Time PCR 系统与SYBR 荧光染料进行检测，反应条件为预变性95 ℃30 s，1 个循环；PCR 反应95 ℃5 s，60 ℃31 s，40 个循环。mRNA 的相对定量采用2-△△Ct法，用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，结果经Champ Gel 5000 全自动凝胶成像系统进行分析，实验重复3 次。

1.4 Western blot 检测目的蛋白表达水平 用裂解液提取蛋白，取总蛋白（60 μg）进行SDS-PAGE电泳，稳压冰浴电转至PVDF 膜上，用5%脱脂牛奶封闭37 ℃2 h，一抗孵育4 ℃过夜，TBST 洗膜。二抗孵育37 ℃1.5 h，TBST 洗膜。ECL 避光孵育PVDF 膜3 min，用C-DiGit Blot Scanner 对条带进行定量分析，实验重复3 次。

1.5 CCK-8 法、流式细胞仪检测细胞增殖能力及周期变化 取对数期细胞接种至96 孔板（100 μL，5 × 103个/孔），在细胞贴壁及培养24、48、72 h 后，加入CCK-8 试剂（10 μL/孔）。3 h 后用酶标仪测定450 nm 处的OD 值。收集细胞，通过流式细胞仪检测各组细胞周期情况，实验重复3 次。

1.6 划痕实验检测细胞迁移能力 取对数期细胞接种于24 孔板（2 × 105个/孔），待细胞生长至融合度为80%～90%时，用无菌枪头（200 μL）刮擦细胞形成纵向划痕，PBS 清洗，在各孔中加入500 μL无血清培养基。在0、12、24 h 时拍照并统计划痕面积，每组取5 个视野进行分析，实验重复3 次。

1.7 Transwell 法检测细胞侵袭能力 在上室加入100 μL 基质胶，37 ℃放置30 min。取100 μL 细胞悬液（1 × 105个）加入上室，下室加入600 μL 完全培养基，37 ℃孵育24 h。用棉签将小室上层细胞轻轻擦去，室温下甲醇固定下层细胞20 min，晾干后置于0.1%结晶紫中染色15 min，PBS 清洗。拍照并统计各组侵袭细胞数，每组随机选取5 个视野进行分析，实验重复3 次。

1.8 统计学方法 应用SPSS 19.0 进行分析，多个样本均数间的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t 法，数据以表示。每项实验均至少重复3 次，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 携带PTEN-Long慢病毒转染的检测结果 当MOI 为50 时，荧光表达率为80%以上（图1～3）。与对照组及空载组相比，RT-PCR 结果显示过表达组PTEN-Long 的mRNA 表达量增加（F=65.42，P＜0.01，图4、表1），Western blot 结果显示过表达组PTEN-Long蛋白表达量增加（F=78.99，P＜0.01，图5、表2）。PTEN-Long 在U251 细胞中稳 定 过表达。

图1 U251 细胞光镜表达（对照组，SP×100，标尺50 μm）Fig.1 Expression of U251 cells by light microscopy（control group，SP × 100，Bar：50 μm）

图2 LV-EGFP 转染U251 细胞的荧光表达（空载组，SP×100，标尺50 μm） Fig.2 Expression of EGFP in U251 cells after transfection of LV-EGFP（empty group，SP × 100，Bar：50 μm）

图3 LV-PTEN-Long-EGFP 转染U251 细胞的荧光表达（过表达组，SP×100，标尺50 μm）Fig.3 Expression of EGFP in U251 cells aftertransfection of LV-PTEN-Long-EGFP（overexpressed group，SP×100，Bar：50 μm）

2.2 PTEN-Long 抑制PI3K-AKT-NF-κB 信号通路的mRNA 表达 随着PTEN-Long 的mRNA 水平增加，过表达组与对照组及空载组比，NF-κB p65（F=53.32，P＜0.01）、bcl-xl（F=933.88，P＜0.01）表达量减少，IκBα（F=26.61，P＜0.01）表达量增加，PTEN-Long 下调PI3K-AKT-NF-κB 信号通路（图4、表1）。

2.3 PTEN-Long 抑制PI3K-AKT-NF-κB 信号通路的蛋白表达 随着PTEN-Long 蛋白表达水平的增加，与对照组及空载组比，过表达组p-Akt（F=56.19，P＜0.01）、NF-κB p65（F=43.65，P＜0.01）、p-NF-κB p65（F=114.68，P＜0.01）、bcl-xl（F=19.26，P＜0.01）表达量减少，IκBα（F=45.23，P＜0.01）表达量增加。PTEN-Long 下调PI3K-AKT-NF-κB 信号通路（图5、表2）。

2.4 PTEN-Long 抑制细胞增殖 通过CCK-8 法检测0、24、48、72 h 的OD 值。与对照组及空载组比，过表达组细胞增殖能力降低（F=18.42，P＜0.01；F=79.72，P＜0.01；F=306.47，P＜0.01）（表3）。通过流式细胞仪检测细胞周期，结果显示过表达组细胞周期被阻滞在G0/G1 期（F=26.32，P＜0.01）（表4）。

图4 通过凝胶电泳分析转染前后mRNA 表达量变化Fig.4 Changes in mRNA expression after transfection were analyzed by agarose gel electrophoresis（n=3）

表1 通过2-△△Ct分析细胞中mRNA 的相对表达量Tab.1 Relative expression of mRNA in cells by 2-△△C（tn=3） ±s

表1 通过2-△△Ct分析细胞中mRNA 的相对表达量Tab.1 Relative expression of mRNA in cells by 2-△△C（tn=3） ±s

注：与对照组及空载组比较，**P ＜0.01

组别对照组空载组过表达组PTEN 1 1.04±0.09 1.13±0.21 PTEN-Long 1 1.16±0.16 69.37±14.62**AKT 1 0.99±0.08 1.02±0.69 NF-κBp65 1 1.03±0.09 0.54±0.07**IκBα 1 1.03±0.18 1.62±0.09**bcl-xl 1 0.99±0.03 0.20±0.03**

表2 细胞中蛋白的相对表达量Tab.2 Relative expression of protein in cells（n=3） ±s

表2 细胞中蛋白的相对表达量Tab.2 Relative expression of protein in cells（n=3） ±s

注：与对照组及空载组比较，**P ＜0.01

组别对照组空载组过表达组PTEN 0.70±0.06 0.67±0.04 0.72±0.05 PTEN-Long 0.28±0.04 0.23±0.03 0.59±0.55*AKT 0.45±0.04 0.44±0.05 0.42±0.07 p-Akt 0.46±0.53 0.44±0.04 0.09±0.05**NF-κBp65 0.71±0.04 0.65±0.04 0.39±0.05**p-p65 0.51±0.04 0.52±0.02 0.20±0.02**IκBα 0.73±0.04 0.69±0.04 0.95±0.03**bcl-xl 0.55±0.06 0.54±0.07 0.29±0.04**

图5 Western blot 检测转染前后各蛋白的表达Fig.5 Expression of protein detected by Western blot（n=3）

表3 PTEN-Long 对细胞增殖的影响Tab.3 The effect of PTEN-Long on cell proliferation（n=3） ±s

表3 PTEN-Long 对细胞增殖的影响Tab.3 The effect of PTEN-Long on cell proliferation（n=3） ±s

注：与对照组及空载组比较，**P ＜0.01

组别对照组空载组过表达组0 h 0.58 0.58 0.58 24 h 1.59±0.09 1.60±0.11 1.21±0.14**48 h 2.29±0.08 2.14±0.09 1.58±0.11**72 h 2.76±0.11 2.61±0.15 1.08±0.08**

2.5 PTEN-Long 抑制细胞迁移 结果显示PTENLong 抑制U251 细胞迁移，过表达组细胞迁移数量少，速度慢。在12、24 h 后，与对照组及空载组比，过表达组细胞迁移能力受抑制（F=128.42，P＜0.01；F=90.41，P＜0.01，图6、表5）。

表4 PTEN-Long 对细胞周期的影响Tab.4 The effect of PTEN-Long on the cell cycle（n=3） ±s

表4 PTEN-Long 对细胞周期的影响Tab.4 The effect of PTEN-Long on the cell cycle（n=3） ±s

注：与对照组及空载组比较，**P ＜0.01

组别对照组空载组过表达组G0/G1（%）55.67±4.93 56.00±10.54 90.33±0.58**

表5 PTEN-Long 对细胞迁移的影响Tab.5 The effect of PTEN-Long on the ability of cells to migrate（n=3） ±s

表5 PTEN-Long 对细胞迁移的影响Tab.5 The effect of PTEN-Long on the ability of cells to migrate（n=3） ±s

注：与对照组及空载组比较，**P ＜0.01

组别对照组空载组过表达组愈合百分比（%）12 h 42.40±4.36 42.94±3.85 11.99±1.67**24 h 63.39±7.82 57.63±5.29 20.20±1.40**

2.6 PTEN-Long 抑制细胞侵袭 结果显示过表达组侵袭细胞数量少。与对照组（124.20±6.29）及空载组（122.10 ± 5.04）相比，过表达组（37.90 ± 7.08）细胞侵袭能力受抑制（F=632.01，P＜0.01，图7）。

3 讨论

PTEN 可通过下调PI3K-AKT 及下游信号通路发挥肿瘤抑制作用，PTEN-Long 同样可以作为PI3K 的拮抗剂，下调PI3K-AKT 信号通路。特殊的是PTEN-Long 比PTEN 多表达的173 个氨基酸赋予其细胞分泌及穿透作用，使其产物通过循环系统在全身发挥作用。

图6 各组细胞迁移情况，黄线区域内为划痕面积Fig.6 The migration of cells in each group，and the scratch area was in the yellow line region（SP×40，Bar：100 μm，n=3）

图7 通过结晶紫染色显示侵袭细胞Fig.7 Invasive cells were visualized by crystal violet staining（SP×100，Bar 50 μm，n=3）

NF-κB 家族成员通常与IκBs 结合并存在于胞浆中。如IκBs 与p65 结合，当IκBα被IKK 磷酸化，NF-κB-IκBs 复合物解离，p65 转位于细胞核与相应靶基因结合，诱导转录。本研究的结果表明，PTEN-Long 抑制AKT 磷酸化，IκBα磷酸化水平降低，进而抑制p65 核转位，影响转录过程，进而抑制细胞增殖。NF-κB 及下游信号通路活化后可促进促血管生成因子的产生，激活内皮细胞内的血管生成信号，促进肿瘤生长和转移。结果显示过表达组细胞迁移数量少，速度慢，侵袭细胞数少于对照组。所以PTEN-Long 通过下调PI3K-AKT-NFκB 信号通路抑制U251 细胞增殖、迁移及侵袭。

NF-κB 活化后可启动cyclinD1 的转录，促进细胞周期由G0/G1 期向S 期的转换，促进细胞增殖，导致细胞恶化、癌变［8］。本研究显示过表达组抑制AKT 及NF-κB 活化，影响NF-κB 对cyclinD1 转录的启动作用，细胞周期被阻滞在G0/G1 期。所以PTEN-Long 通过下调PI3K-AKT-NF-κB 信号通路阻滞细胞周期，抑制细胞增殖。NF-κB 与细胞存活及凋亡密切相关，PI3K-AKT 通过激活NF-κB 诱导抗凋亡基因表达增加。PTEN-Long 抑制PI3KAKT-NF-κB 通路活性，进而抑制NF-κB 激活引起的凋亡耐受作用，抑制抗凋亡基因Bcl-xl 的表达。本研究结果显示，PTEN-Long 具有促进肿瘤细胞凋亡的作用。

有研究表明PTEN-Long 前导序列本质上是无序的［9］，富含翻译后修饰，增加了PTEN 的治疗活力，使PTEN-Long 前导序列可被用于递送治疗性蛋白质的有效载体，如PTEN-L-p53 显着抑制U251的增殖、迁移和侵袭［10］。这提供了一种新方法来改善临床中的癌症治疗［10-11］，避免腺病毒介导治疗的不良反应。研究显示PTEN-Long 表达产物可以降低p-Akt 水平并抑制U87 增殖［12］，抑制HCV 复制［13］，抑制肾癌细胞生长［14］，还可抑制PINK1-Parkin 介导的线粒体自噬［15］。鉴于PTEN-Long 的优势，其有可能成为基因治疗的新靶点。

综上，实验结果证实了PTEN-Long 可在U251中通过下调PI3K-AKT-NF-κB 信号通路发挥肿瘤抑制作用。特殊的是胶质瘤的治疗存在血脑屏障问题，下一步可构建裸鼠脑肿瘤模型，继续探索PTEN-Long 对胶质瘤的作用及机制。

感谢：感谢河北大学附属医院中心实验室各位老师的帮助。