桂皮醛对db/db糖尿病小鼠胰岛形态与功能的影响

王丹 王芳 杨怡 万进东 刘森 冉飞 夏思维 王沛坚

成都医学院第一附属医院1心血管内科，2衰老与血管稳态四川省高等学校重点实验室（成都610500）

有研究数据表明，全球糖尿病（diabetes mellitus，DM）患者近4 亿，我国已达1.14 亿，成年人中更有约50%属DM 前期［1］。2 型DM（type 2 diabetes mellitus，T2DM）的发生、发展与胰岛素抵抗和胰岛功能衰竭等因素密切相关［2］。

研究发现，一些膳食因素和天然药物成分具有良好的降糖和改善胰岛素抵抗的作用，且不良反应少，患者依从性好。近年研究［3-6］表明，来源于我国传统中药肉桂中的桂皮醛（cinnamaldehyde，CA）具有降低血糖、改善脂质代谢、舒张血管、抗氧化应激的作用。CA 可通过刺激骨骼肌葡萄糖摄取和糖原生物合成，激活糖原合酶，和抑制糖原合成酶激酶-3 的方式改善糖代谢［7］。以上研究着重探讨了CA 改善糖代谢作用，但对胰岛形态及功能的作用尚不明确。为此，在本研究中，将采用db/db 小鼠作为研究对象，观察CA 对其胰岛形态及功能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 本实验于2017年4月开始，将8周龄SPF 级雄性db/db 小鼠20 只（35～40 g，购于南京大学实验动物中心），分普通饮食组（db/db Cont，n=10）和0.2%CA（饲料中添加0.2%CA）饮食组（db/db CA，n=10）。另取背景相同的血糖正常小鼠C57BL/KsJ（17 ～25 g，n=10）给予普通饮食作为对照（C57 Cont，n=10）。每笼小鼠5 只，小鼠自由进食。自然昼夜采光，室温（21 ± 2）℃，湿度60%±10%。

1.1.2 实验试剂 CA（Sigma，美国）；水合氯醛、二甲苯和无水乙醇（中国上海凌峰化学试剂厂）；中性树胶（中国上海懿洋）；多聚甲醛（中国上海生工）；苏木紫染液及伊红染液（中国南京建成）；小鼠胰岛素抗体及优泌林普通胰岛素（Santa Cruz，美国）；小鼠胰岛素ELISA 试剂盒（中国北京福瑞生物工程公司）；FITC 标记的抗鼠二抗（Invitrogen，美国）；抗荧光淬灭封片液（中国碧云天）；血糖仪及血糖试纸（美国强生）。

1.2 观察指标

1.2.1 空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）检测 小鼠禁食6 h，利用血糖仪对鼠尾静脉血糖进行测量，记录血糖值，结束后用酒精消毒创面。

1.2.2 胰岛素耐量试验（intraperitoneal insulin tolerance tests，IPITT）［8］腹腔注射普通胰岛素（0.75 U/kg）后，分别测0、15、30、45、60 min 鼠尾血糖值。以初始血糖值为100%，计算不同时间点鼠尾血糖值与初始血糖值的百分比。

1.2.3 胰岛形态观察［9］干预结束后，小鼠禁食6 h后以10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉，在获取颈动脉血液标本后立即从小鼠腹腔中分离胰腺组织，包埋后在-20 ℃冷冻条件下切片，厚度为10 μm；4%多聚甲醛固定10 min 后，苏木紫染色1 min，冲洗3 次；1%盐酸酒精分化30 s 至1 min，冲洗3 次；流水返蓝10 min；伊红染色30 s，冲洗3 次；将切片分别放入75%酒精、95%酒精、无水酒精中3 s；二甲苯浸入2 次，每次5 min；晾干后中性树胶封片，正置显微镜下观察拍照。

1.2.4 胰岛分泌胰岛素水平检测［9］胰腺组织包埋切片同前；4%多聚甲醛固定40 min，双氧水甲醇溶液浸泡30 min 后；PBS 轻柔冲洗3 次，再用10%胎牛血清封闭30 min；加入抗小鼠胰岛素抗体（1∶1 000），同时设置对照组，用PBS 替代胰岛素抗体4 ℃过夜；孵育结束后常温放置30 min，用PBS 清洗3 次，每次10 min；加入FITC 标记的抗鼠二抗，室温避光30 min；PBS 清洗3 次，每次10 min；倒置荧光显微镜下观察拍照，并计算胰岛面积。

1.2.5 血浆胰岛素水平检测 小鼠成功麻醉后，从颈动脉处取抗凝血约1 mL，离心（3 000 r/min）15 min 后取血浆，样品及标准品加入酶标包被板中37 ℃反应30 min；洗板5次后加入酶标试剂，37 ℃反应30 min；洗板5次后加入显色液显色10 min；加入中止液；酶标板放入酶标仪中读取OD值。

1.3 统计学方法 所有数据均以均数±标准差表示，以SPSS 16.0 进行数据录入，两组间比较采用非配对t检验进行比较分析，两组以上采用oneway方差分析，以Prism6.01 软件制图，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CA 对db/db 小鼠空腹血糖和胰岛素耐量试验的影响 在对小鼠每周的空腹血糖水平监测中发现，与C57 Cont 相比，db/db Cont 组血糖升高明显，但在膳食中添加0.2%CA 干预12 周后，与db/db Cont 组比较，db/db CA 组空腹血糖下降明显（P＜0.05，图1A）。本实验中小鼠胰岛素耐量试验结果提示，与C57 Cont 及db/db Cont 组相比，CA 能够显著增高db/db 小鼠改善胰岛素敏感性（P＜0.05，图1B），以上结果提示膳食CA 可显著降低db/db小鼠空腹血糖，改善db/db 小鼠胰岛素抵抗，这为CA 治疗T2DM 提供理论基础。

图1 CA 对db/db 小鼠空腹血糖、胰岛素敏感性的影响Fig.1 Effects of CA on fasting blood glucoseandinsulin sensitivityin db/db mice

2.2 CA 对db/db 小鼠胰岛形态的影响 H&E 染色观察CA 对db/db 小鼠胰岛形态的影响。实验发现，相比于C57 Cont 组，db/db Cont 组的胰腺组织出现明显肥大，胰岛细胞排列较紊乱，胰岛面积明显增大，而CA 干预后能显著改善上述现象（P＜0.01，图2），上述结果表明CA 可改善db/db 小鼠胰岛形态，提示CA 改善糖代谢的作用可能与受损胰岛细胞的修复有关。

图2 H&E 染色观察db/db 小鼠胰岛形态Fig.2 H&E staining of islet morphology in db/db mice

2.3 CA 对db/db 小鼠胰岛素分泌功能的影响 免疫荧光染色。结果提示db/db Cont 组胰岛中胰岛素含量低于C57 Cont 组，但db/db CA 组胰岛中胰岛素水平较db/db Cont 组明显升高（P＜0.01，图3），表明CA 可通过修复胰岛细胞功能、促进胰岛分泌胰岛素来改善糖代谢。

图3 荧光染色观察db/db 小鼠胰岛中胰岛素水平Fig.3 Immunofluorescence staining of islet insulin levels in db/db mice

2.4 CA 对db/db 血浆胰岛素水平的影响 胰岛素ELISA 试剂盒测定CA 对db/db 血浆胰岛素水平的影响。实验发现，相比于C57 Cont 组，db/db Cont 组的胰岛素水平下降明显；而与db/db Cont 组相比，db/db CA 组胰岛素水平明显升高（图4；P＜0.01）。结果表明，CA 具有升高血浆胰岛素水平的作用，进一步肯定了CA 在糖代谢中的重要作用。

图4 CA 对db/db 小鼠血浆胰岛素水平的影响Fig.4 Effects of CA onplasma insulin levelindb/db mice

3 讨论

近年来，T2DM 所致的大血管及微血管并发症使冠心病、慢性肾功能衰竭、脑卒中、糖尿病视网膜病变等疾病的发生率逐年升高［1］；对人类的健康和生命造成严重威胁，因此积极寻找控制血糖，治疗糖尿病及其相关并发症的药物及干预方法对于降低糖尿病导致的致死、致残率，改善患者生活质量，减轻社会负担有重要的意义。

胰岛具有分泌胰岛素与胰高血糖素等激素的功能，在糖代谢、脂代谢等代谢途径中起着非常重要的作用。其中胰岛β 细胞具有分泌胰岛素的功能，其衰竭是T2DM 发病的中心环节。而持续性高血糖刺激可导致胰岛β 细胞退化成无效的β 细胞，进而丧失部分及全部的胰岛素分泌功能［10］，因此保护和改善胰岛β 细胞对T2DM 的治疗尤其重要。CA 原产于斯里兰卡和印度的南部，当地传统医师用于治疗糖尿病。随着医学的不断发展，他人研究发现CA 可通过上调小鼠骨骼肌葡萄糖转运蛋白4（glucose transporter 4，GLUT4）基因表达来下调血糖［11］，可通过抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1B（protein tyrosine phosphatase.1B，PTP.1B）来改善胰岛素抵抗，从而达到治疗和预防糖尿病的作用［12］。然而CA 对胰岛形态及功能作用未作进一步研究，为此，本课题组以胰岛作为切入点进一步展开研究。

本研究发现CA 可显著降低db/db 空腹血糖水平，研究证实CA 可通过增加葡萄糖摄取和改善肝脏中的糖原合成从达到降低空腹血糖作用［13-14］。CA 可增加胰岛素敏感性，有文献提示CA 可通过降低血浆中炎症因子及抑制炎症因子的表达来改善胰岛素抵抗［15］。在本实验中进一步观察了CA对小鼠胰岛形态及功能的影响。结果发现CA 可显著改善db/db 小鼠胰腺体积增大及胰岛细胞排列紊乱，同时能增加胰岛素分泌量和升高血浆胰岛素水平；此外，有研究发现，激活核因子E2相关因子2（nuclear factor E2.related factor 2，Nrf2），可减轻氧化应激对胰岛β细胞损伤、改善STZ 诱导的糖尿病模型的代谢紊乱［16-17］，但CA 对db/db 小鼠胰岛形态与功能的保护作用，是否与激活Nrf2 有关是后期的实验研究重点。

综上所述，CA 可改善db/db 小鼠胰岛形态及功能，从而改善糖代谢；这为糖尿病患者的治疗提供了新的理论基础，有利于开发新的干预靶点和治疗措施。