IVIM评价兔VX2肿瘤血管生成的实验性研究

杨亚旭 李跃华 魏小二

肿瘤微血管密度已经作为评估肿瘤微血管生成的重要标志之一，是代表性的量化指标，其与血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达正相关。MVD增加，肿瘤浸润和转移的恶性潜能也显著增加，是肿瘤侵袭性的特征性生物学指标之一[1]。然而，目前评价MVD的方法是创伤性的、要求取材非常准确，并且无法对肿瘤血管生成活性进行功能评价，因此这些缺点使之不能成为一

种理想的检查手段。体素内不相干运动（intravoxel incoherent motion，IVIM）最早由Le等[2]学者提出，是一种多b值、无创性以及可重复性反映活体组织水分子运动的成像方法，对肿瘤解剖结构的显示、肿瘤血管生成的评估以及抗肿瘤血管的疗效和预后有着重大价值。国外学者已经应用IVIM技术针对中枢神经系统[3]、乳腺病变[4]、肝硬化[5]、肾脏[6]及胰腺病变[7]进行成像，然而在软组织肿瘤方面的研究还鲜有报道。

方 法

1.基本材料

将40只新西兰大白兔随机分为4组，分别为1周组（10只）、2周组（10只）、3周组（10只）、4周组（10只），以正常大腿肌肉组织作为对照组。将荷瘤兔肿瘤取出剪碎后制成VX2肿瘤悬液，将肿瘤悬液注入兔大腿肌肉内制作成实验兔后进行磁共振扫描。

2.MR扫描设备参数

上述4组实验兔在VX2瘤细胞植入后1周均进行磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）扫描，明确4组肿瘤种植是否成功以及了解4组间VX2肿瘤的初始状况，同时1周组MRI扫描结束后处死荷瘤兔、取出肿瘤组织进行分析。完成第一次MRI扫描后，2周组在种植后2周、3周组在种植后3周、4周组在种植后4周进行MRI扫描，各组在MRI扫描后处死实验兔，取出肿瘤组织进行分析。

采用 3.0T 临床用MRI扫描仪（Ingenia， 荷兰飞利浦公司）和8通道头颅表面线圈（上海辰光医疗科技股份有限公司）进行扫描。具体扫描序列和 扫 描 参 数 如 下：T2W： TR/TE=2800/100ms，NSA=4， 层 厚 =2mm， FOV=180×180mm，矩 阵=224×224。T1W 和 增 强 后 T1W（post-T1W）：TR/TE=500/20ms， NSA=4， 层 厚 =2mm，FOV=180×180 mm，矩阵=224×224。DWI（弥散加权成像）采用ss-EPI序列（单次激发平面回波序列）来完成：TR/TE=2000/86ms， NSA=4，层厚=2mm，FOV=180×180mm，矩阵=75×75，b值分别为0，800s/mm2，ADC图由扫描机器自带软件自动生成。IVIM序列参数与DWI一致，但是b值不同，b值分别采用0、25、50、75、100、150、200、400、600、800s/mm2。增强扫描如下：经兔耳缘静脉按0.1mmol/kg注射Gd-DTPA（马根维显，469.01mg/ml，拜尔先宁）后，进行增强后T1W扫描，扫描参数如前所述。

3.数据处理

将IVIM数据传输至后处理工作站，利用MRI/DWI Toolbox后处理软件包生成D、D*、f伪彩图。以T2W、T1W、post-T1W图像为参考，在T2W横断面图像中选取肿瘤组织最大层面图像，避开囊变坏死，在肿瘤实性部分取3点作为ROI（region of intrest）区进行测量，分别测量D、D*、f值，三点平均值作为测量最终结果，ROI面积3.2～4.0cm2，平均3.5cm2。以post-T1W图像为基础来计算各组VX2肿瘤体积。同时在VX2肿瘤同侧大腿肌肉划定感兴趣区，测量上述MRI定量参数作为参照。

4.组织学分析

实验兔在完成MRI扫描后处死实验兔，将位于两侧后肢根部背侧的VX2肿瘤完整剥离切除，经10%甲醛溶液固定，切取相应组织块进行石蜡包埋，选取与MRI像最大层面相对应的石蜡块进行切片，分别进行苏木精-伊红（HE）染色和CD34免疫组化分析。最后再对CD34的结果进行半定量分析，来计算微血管数。

5.统计学分析

使用 SPSS 16.0进行统计学分析（Chicago，IL，USA)，P＜0.05被认为有统计学意义。所有数值均输入到excel表格并以均数±标准差来表示。使用单因素方差分析分析各组间病灶体积、MVD数以及各MRI参数之间的差异，利用Pearson相关检验分析MRI参数与MVD指数之间的相关关系。

结 果

1.一般情况

4组实验兔均完成了最终的MRI扫描，所有实验兔均造模成功，共发现80个VX2肿瘤。4组实验兔的肌肉组织的ADC值、D值、D*值和f值之间均无明显统计学差异（P均＞0.05），表明本研究所采用的MRI-IVIM扫描以及后处理方法也是稳定、可靠的。此外，各组在肿瘤种植后1周时肿瘤体积、ADC值、D值、D*值和f值之间也均无统计学差异（P均 ＞0.05）。

2.肿瘤体积、MVD以及ADC值、D值、D*值和f值参数的动态变化

随着时间的推移，肿瘤体积急剧增加，在2周时出现坏死。2周组体积大于1周组（P=0.054），3周组大于2周组（P＜0.001）、4周组大于3周组（P＜0.001）。关于VX2肿瘤的ADC值，2周组的小于1周组（P＜0.001），3周组小于2周组（P＜0.001），4周组也小于3周组（P=0.013）。肿瘤的MVD在肿瘤的不同阶段也存在差异，2周组的MVD大于1周组（P＜0.001），3周组的 MVD大于 2周组（P＜0.001），而4周组的MVD也小于3周组的MVD（P＜0.001）。2周组的f值大于1周组（P＜0.001），3周组的f值大于2周组（P＜0.001），而4周组的f值小于3周组（P＜0.001）。2周组的D值小于1周组（P＜0.001），3周组的D值小于2周组（P=0.004），而3周组和4周组D值之间的值无明显统计学差异（P=0.212）。2周组的D*值大于1周组（P＜0.001），3周组的D*值小于2周组（P＜0.001），而4周组的D*值相对于3周组有降低的趋势（P=0.067）（表1，图1、2）。

表1 各组VX2肿瘤ADC值、MVD计数、D值、D*值和f值之间的比较

表2 VX2肿瘤的ADC值、D值、D*值和f值与MVD计数之间的相关性

图1 每组代表性实验兔的MRI图像。不同时间点的VX2肿瘤，其ADC值、f值、D值和D*值也发生动态变化。

图2 每组代表性实验兔的CD34免疫组化图。CD34染色显示CD34阳性内皮细胞染成褐色，与相邻肿瘤细胞有明显分离，不同时间点的VX2肿瘤CD34阳性存在差异。

3.MRI-IVIM定量参数与MVD计数之间的相关性

4周组D*值与MVD计数之间存在统计学相关性趋势，其他各组D*值和f值与MVD计数之间均存在统计学相关性，而各组ADC值和D值与MVD计数之间均无明显统计学相关性（表2）。

讨 论

本研究采用弥散序列成像来反映肿瘤组织内的灌注信息，尽管弥散与灌注之间存在一定的联系，但两者之间仍然存在一定的差异。目前临床内应用的弥散序列所包含的不仅仅是水分子运动的信息，也包含了毛细血管灌注信息，即在小b值弥散成像时所得到的ADC值主要由毛细血管内的血液灌注所贡献。本研究在应用多b值成像时利用低b值的图像部分从而获得肿瘤内的灌注信息。从病理学角度来看，毛细血管内灌注与肿瘤内MVD密切相关，其血管密度直接决定了单位时间内从毛细血管内流入肿瘤细胞内的血流量。从本研究结果来看，随着VX2肿瘤的进展，MVD的变化与D*及f值呈一定的相关性，而与ADC及D值无明显相关性。对此我们的解释是MVD主要反映了肿瘤微血管的定量指标，即在单位组织内毛细血管的量化。D*值主要是反映毛细血管内流出到组织间隙的灌注值，f值反映的是微循环灌注所占整个血流灌注的比值。本研究中在肿瘤生长早期的大多数肿瘤细胞处于G1期及S期，VX2的种植时间延长，肿瘤的进展，在S期及G2期其表达急剧增加，肿瘤细胞增殖活跃，其侵袭性更强、恶性程度更高，其特征表现为肿瘤微血管的密度增加。随着肿瘤进展，肿瘤细胞密度相对增加，其对应的影像学指标ADC值相对也降低，同时D值是反映水分子弥散的指标，随着肿瘤进展，D值下降，这与以往研究结果较为一致。Chandarana等[8]在以IVIM研究肾脏时发现，D*及f值针对肾脏肿瘤的定性与分型具有重要的意义。在与病理对照研究发现，f值及D*值可以反映肿瘤血管的密集程度与VEGF的表达。而本研究中的其他参数如ADC值在b值＞200mm2/s所反映主要是水分子弥散与血流灌注的综合值；D值则反映的是水分子弥散的实际情况，二者与肿瘤血管的量化相关性不如f值及D*值。本研究只研究到肿瘤种植后的28天，其主要原因为在28天左右的大体病理标本中已经出现肿瘤的坏死。在肿瘤出现坏死后，影响其血流灌注的因素将多样化，随着肿瘤细胞进展，肿瘤的供血不足时，肿瘤细胞的灌注不仅仅由MVD所决定，其他因素如组织内静水压在肿瘤进展末期由次要因素变为主要因素。

肿瘤血管生成是实体性肿瘤生长和转移的基础，间质流体压力（IFP）是反映肿瘤血管的一项指标，在正常组织中，新生血管受促血管生成因子和抗血管生成因子的共同作用调控，处于一种平衡状态。然而肿瘤组织中，这种平衡被打破，导致杂乱的不正常新生血管生成， 这些不正常的结构导致了肿瘤血管上的渗漏及血管中血液的异常，进而导致淋巴系统的异常，因此增加了组织液压。肿瘤部位的异常脉管系统与较高的IFP阻碍了药物的传输，并且有研究指出IFP在肿瘤缺氧、周围血管生成、肿瘤周围淋巴管生成和淋巴结转移的发展中起着重要作用。因此，IFP已被认为是治疗实体肿瘤的关键障碍之一。比较困难的是目前没有可靠的生物标志物来检测IFP。先前研究表明，IFP的升高会导致肿瘤血流减少，我们假设可以用扩散加权图像（DWI）作为一种手段来检测毛细血管血流减少。Kim等[9]采用扩散加权图像（DWI）对乳腺癌模型小鼠进行研究，并在此基础上进行了针刺IFP测定。用传统的单指数模型和双指数模型进行Voxel分析后得出结论：扩散系数D与IFP相关，IFP与f和D*的中位数乘积相关，支持使用IVIMDWI指标作为肿瘤IFP的无创生物标志物，利用这一无创性的成像方法在抗肿瘤血管生成治疗中发挥重要作用。

综上所述，非侵入性、快速、可重复地显示肿瘤血管特征的特性，对于评估肿瘤血管生成，抗血管生成药物疗效和预后具有重要的临床意义。本研究以兔的肌肉组织VX2模型为研究对象，采用IVIM 成像技术研究不同时期肿瘤内MVD变化，发现IVIM成像可以用来评价肿瘤血管的特性并具有一定的价值。