二甲双胍对2型糖尿病大鼠胆汁酸代谢FXR-MAFG-CYP8B1信号通路的影响

李萌思雨，胡晓文，徐业秋，胡晓琳，张春雪，逄曙光,

(1 济南大学 山东省医学科学院医学与生命科学学院，济南250013；2 山东大学附属济南市中心医院)

2型糖尿病(T2DM)主要表现为糖脂代谢紊乱，胆汁酸(BA)作为糖脂代谢的重要信号分子，其主要通过BA受体(FXR)介导的多种信号通路发挥重要的生理作用[1]。BA既是肝脏胆固醇分解代谢的主要途径，又能促进肠道膳食脂肪的吸收。BA激活FXR后，可抑制甾醇调节元件结合蛋白的表达，进而改变脂类代谢相关基因的表达；能够诱导过氧化物酶体增殖物激活受体α的表达，进而促进脂肪酸氧化[2]；还能够降低磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和葡萄糖-6-磷酸酶的表达，从而抑制糖异生[3]。胆固醇通过经典途径和替代途径合成BA。经典途径是BA合成的主要途径，合成大约等量的胆酸(CA)和脱氧胆酸(CDCA)；胆固醇7α羟化酶(CYP7A1)是经典途径的限速酶，而胆固醇12α羟化酶(CYP8B1)可以催化CDCA向CA转化[4]。最近研究表明，V-Maf肌肉腱膜纤维肉瘤癌基因同源物G(MAFG)是FXR的靶标，是BA合成和代谢的关键转录抑制因子[5]。研究显示MAFG降低肝脏中CYP8B1的转录水平[5，6]。由此可见，FXR-MAFG-CYP8B1信号通路在BA代谢中具有重要作用。研究发现，糖尿病大鼠的BA池增大，而胰岛素治疗能够降低BA池的大小、抑制CYP7A1、CYP8B1活性，并改变BA的组成[7]。二甲双胍可以降糖降脂，该作用是否通过影响BA代谢发挥作用尚未可知。2017年12月～2018年10月，我们观察了二甲双胍对T2DM大鼠FXR-MAFG-CYP8B1信号通路的影响，从胆汁代谢通路探讨其治疗糖尿病的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要试剂 60只雄性Wistar大鼠，8周龄，体质量200～250 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司；将动物于(23±2)℃、12 h光照/黑暗循环环境下常规喂养，实验操作符合实验动物伦理委员会要求。FXR抗体购自Biorbyp公司；CYP8B1、MAFG抗体购自Abcam公司；PVDF膜(0.2 mm)、ECL检测试剂盒购自Millipore公司；链脲佐菌素(STZ)购自Sigma公司；盐酸二甲双胍购自中美上海施贵宝制药有限公司；CA ELISA试剂盒购自上海通蔚生物有限公司；TRIzol、RNA抽屉试剂、反转录反应和实时荧光定量PCR反应试剂盒购自TaKaRa公司。血糖仪、Cobas8000自动生化分析仪购自罗氏公司；胰岛素ELISA试剂盒购自Mercodia公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组与造模干预 将60只大鼠适应性喂养1周后，随机分为3组各20只。对照组喂食标准饮食(6%脂肪，64%碳水化合物,23%蛋白质)，模型组、干扰组喂食高脂饮食(25%脂肪，48%碳水化合物，20%蛋白质)。喂养10周后，模型组、干扰组腹腔注射小剂量STZ 30 mg/kg诱导T2DM模型，对照组腹腔注射等量生理盐水。STZ注射后72 h，模型组、干扰组用血糖仪测量空腹血糖(FBG)≥11.1 mmol/L，成功建立T2DM模型。干预组给予二甲双胍500 mg/(kg·d)灌胃，其余两组给予等量生理盐水灌胃，连续干预12周。

1.2.2 一般情况观察及标本收集 每天早晨观察大鼠精神状态，记录并计算32周龄时与入组时食物摄入量、水摄入量和体质量变化。在32周龄时禁食过夜，眶后静脉丛取血，分离血清后-80 ℃冰箱保存；脱颈处死后剖腹取出肝组织，置于液氮中冷冻。

1.2.3 血清糖脂代谢指标及BA检测 取静脉血清，使用Cobas8000自动生化分析仪检测总胆固醇(TC)、总甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、BA，用血糖仪测FBG，用ELISA试剂盒检测空腹胰岛素(FINS)。胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)=[FBG(mmol/L)×FINS(μU/mL)]/22.5。

1.2.4 肝组织FXR、MAFG、CYP8B1 mRNA检测 采用实时荧光定量PCR法。使用TRIzol试剂提取肝脏总RNA，在紫外分光光度计下读取A260/A280值。用TaKaRa两步法反转录试剂盒将RNA样品反转录为cDNA，按照PCR反应液配比说明书配成20 μL反应体系。反应条件：预变性95 ℃ 30 s；PCR反应95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40个循环；解离95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。反应中所用引物序列:FXR正向5′-AAGTGACCTCCACGACCAAG-3′，反向5′-TGGCATTCTCTGTTTGCTGT-3′；MAFG正向5′-CCCAATAAAGGAAACAAGGCC-3′，反向5′-GCACCGACATGGTCACCA-3′；CYP8B1正向5′-TCCATATGTCCCGGCAGGTTCTTT-3′，反向5′-TGTCAGGGTCCACCAGTTCAAAGT-3′；β-actin正向5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA -3′，反向5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′。每组设3个复孔，以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

1.2.5 肝组织FXR、MAFG、CYP8B1蛋白检测 采用Western blotting法。制备大鼠肝脏匀浆，4 ℃下以10 000 r/min离心10 min；收集上清液，BCA测定总蛋白质浓度。加入4×上样缓冲液(蛋白质与蛋白质上样缓冲液比例为4∶1)，将混合物在100 ℃水中煮沸8 min。将等量蛋白质加载至12% SDS-PAGE上，再转移到PVDF膜上。将膜在PBST/5%脱脂奶粉中封闭，4 ℃下与针对FXR、MAFG、CYP8B1、β-actin的一抗孵育过夜。用磷酸盐缓冲液和0.05% Tween-20(PBST)洗涤后，将与HRP缀合的二抗于室温下孵育4 min。去除二抗后，使用ECL试剂盒洗涤印迹，在自动凝胶成像分析系统上成像。以Image J图像处理软件计算目的蛋白与内参光密度比值，以此表示目的蛋白的相对表达量。

1.2.6 肝组织CA检测 采用ELISA法。称取1 g肝组织样品，加入9 g PBS(pH 7.2～7.4)并搅匀。以2 000～3 000 r/min离心20 min，收集上清液。将一部分包装进行测试，其余部分冷冻备用。用ELISA试剂盒检测CA，按说明书操作。

2 结果

2.1 各组大鼠一般状况比较 实验过程中，对照组一般状态好，饮食、饮水、体质量无明显改变；模型组消瘦，毛色杂乱，精神萎靡，饮食、饮水量增加；干扰组给予二甲双胍干预后症状较模型组好转。与对照组比较，模型组和干扰组体质量减轻，饮食和饮水增加(P均<0.05)；与模型组比较，干扰组二甲双胍治疗后体质量、饮食和饮水均减少(P均<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠体质量、饮食、饮水变化

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05。

2.2 各组血清糖脂代谢指标及BA水平比较 与对照组比较，模型组FBG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C、BA水平均升高而HDL-C水平降低(P均<0.05)。与模型组比较，干扰组FBG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C、BA水平均降低而HDL-C水平升高(P均<0.05)。见表2。

表2 各组血清糖脂代谢指标及BA水平比较

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05。

2.3 各组肝组织FXR、MAFG、CYP8B1 mRNA及蛋白表达比较 与对照组比较，模型组肝组织FXR、MAFG表达下调而CYP8B1表达上调(P均<0.05)；与模型组比较，干扰组肝组织FXR、MAFG表达上调而CYP8B1表达下调(P均<0.05)。见表3。

2.4 各组肝组织CA比较 对照组、模型组、干扰组肝组织CA分别为(442.58±86.18)、(1 208.90±127.21)、(620.98±35.48)ng/mL，模型组>干扰组>对照组(P均<0.05)。

表3 各组肝组织FXR、MAFG、CYP8B1表达比较

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05。

3 讨论

T2DM是与血脂异常和胰岛素抵抗相关的炎性疾病。在本研究中，我们通过给予高脂饮食喂养和小剂量STZ注射建立了T2DM大鼠模型。据报道，高脂饮食喂养引起胰岛素抵抗，STZ对胰岛β细胞有毒性作用。当注射大剂量STZ时，可破坏大多数胰岛β细胞以诱导T1DM模型；而注射小剂量STZ可用于制备T2DM模型，表现出血糖升高及胰岛素抵抗[8]。本研究结果表明，干预组T2DM大鼠经二甲双胍治疗后体质量减轻且饮食、饮水量均减少，同时FBG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C水平均降低而HDL-C水平升高，临床症状、糖脂代谢、胰岛素抵抗均得到改善；此外，干预组经二甲双胍干预后BA也明显下降。因此，我们推测二甲双胍改善糖脂代谢的作用可能与影响BA代谢有关。

在肝内由胆固醇直接合成的BA称为初级BA，初级BA进入肠道由肠道菌群催化合成次级BA[9]。肝脏产生的BA进入肠道后，95%会被肠道重吸收，这些重吸收的BA随门静脉再次进入肝脏，肝脏再将其与新合成的BA一起进入肠道，即“肝肠循环”。经典途径是BA合成的主要途径，该过程主要依靠CYP7A1来发挥作用。生理浓度的BA结合并激活FXR，FXR通过诱导小异二聚体伴侣(SHP)下调CYP7A1的表达[5]，从而负反馈抑制BA合成。本研究结果显示，与对照组比较，模型组肝组织中FXR表达减少，与相关研究结果一致[10]。T2DM大鼠FXR表达降低的具体机制尚不清楚，可能与糖尿病大鼠BA池的改变有关。CDCA是最有效的FXR激活配体，糖尿病大鼠BA库中CA和脱氧胆酸(DCA)增加而CDCA减少[11]，对FXR激活作用降低。MAFG作为FXR激活介导的转录阻遏物[6]，当糖尿病大鼠FXR表达降低时，MAFG表达也降低，同时MAFG抑制其下游基因的表达。在BA合成途径中，CYP8B1负责CA合成[7]。研究发现，在STZ诱导的糖尿病大鼠中，CYP8B1表达升高[12]。这是由于MAFG在糖尿病大鼠中表达降低，减弱了对CYP8B1的抑制作用使得CYP8B1表达增加，致使糖尿病大鼠CA升高。与我们的实验结果相一致，即模型组CA浓度高于对照组。

本研究结果显示，二甲双胍治疗后干扰组大鼠FXR和MAFG表达增加而CYP8B1表达降低。这表明二甲双胍可以通过活化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)，使得FXR磷酸化[13]，受FXR激活的MAFG表达增加，对CYP8B1的抑制作用增强，因而CYP8B1表达降低。丙酮酸激酶(PEPCK)和葡萄糖6磷酸酶(G-6-PASE)是参与糖异生的限速酶。研究表明，FXR抑制PEPCK和G-6-PASE的活性，阻碍糖异生过程，从而改善葡萄糖耐量[14]。固醇调节元件结合蛋白(SREBP-1c)是调节胆固醇代谢和甘油三酯合成的关键酶。研究发现，FXR诱导SHP的表达后，与肝X受体(LXR)结合后抑制SREBP-1c的表达，进而降低胆固醇和甘油三酯合成[15]。此外，MAFG作为FXR的下游因子发挥其共调节作用，参与FXR的降低糖脂作用以调节体内糖脂平衡[5，6]。

BA合成途径的直接产物主要是CA和CDCA，它们的相对量之间的平衡决定了BA池的总体疏水性[16]。CA和CDCA之间平衡的主要调节剂是CYP8B1，CYP8B1确定了12α-羟基化BA和非12α-羟基化BA的相对量。CA是肝组织中含量最丰富的12α-羟基化BA。Kim等[14]研究表明，人胰岛素抵抗与血清12α-羟基化BA水平升高有关。Kaur等[7]发现，CA的缺乏导致CYP8B1缺陷小鼠的胰岛素抵抗改善。本研究结果显示，干预组肝组织中CA表达减少，HOMA-IR降低，胰岛素抵抗明显改善。这是由于二甲双胍抑制CYP8B1表达后降低CA表达，促进血清12α-羟基化BA表达，从而改善了胰岛素敏感性[18]；同时，CA的减少也降低了胆汁中胆汁盐的疏水性，降低胆固醇的溶解度[19]，从而减少胆固醇的吸收。因此，我们认为二甲双胍可以通过调节FXR-MAFG-CYP8B1信号通路来干扰BA代谢，从而改善糖脂代谢和胰岛素敏感性，这对进一步探索二甲双胍的新药物靶点具有重要意义。