芹菜籽提取物灌胃对大鼠慢性高原病的治疗作用

周彬，武贵臻，迪丽努尔·买买提依明，杨涛，木尼热·艾合买提，艾尼娃尔·艾克木

(1新疆医科大学，乌鲁木齐 830011；2新疆医科大学第一附属医院)

高原低氧环境主要表现为低压低氧、气候多变、太阳照射强等，其中低氧造成的损伤对机体健康有显著的影响[1]。如机体长时间暴露于高原低氧环境，会发生低氧失代偿，从而引发高原肺动脉高压等慢性高原病(CMS)[2]。肺血管收缩反应的持续增强会导致慢性缺氧诱导的肺动脉高压和小肺动脉的结构重塑，肺动脉高压状态持续会累及心脏，从而发展为右心室肥厚，严重导致心力衰竭，危及生命[3]。芹菜，属伞形科植物，芹菜籽是芹菜的种子，含多种生理学活性的物质，主要包括挥发油化合物、不饱和脂肪酸、黄酮类物质、丁基苯酞类、氨基酸、膳食纤维、香豆素及其衍生物等，具有降血压、降血脂的生理功能[4,5]。新疆少数民族医学中以芹菜籽入药，认为其性干热，具有健脑安神、活血、祛风除湿的功效，是多种护肝减压的传统药方中的主药[6,7]。课题组对芹菜籽分别用乙醇和水进行提取，醇提物中高脂溶性成分水平较高，含有丰富的苷原，水提物含有极性较大的化学成分及丰富的糖苷成分。本研究通过建立大鼠CMS模型，并用芹菜籽不同提取物进行干预，通过观察大鼠肺动脉压(PAP)及血清CRP、VEGF、EPO、Apo-A1和心脏组织形态学，探讨芹菜籽提取物对大鼠CMS是否具有治疗作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物、药物、试剂及仪器 健康SD大鼠50只，体质量160～200 g，由新疆医科大学实验动物中心提供[许可证号：SYXKI(新)2016-0003]；芹菜籽(新疆和田麦迪森有限公司，批号：C41097804)，硝苯地平(山西云鹏制药有限公司，批号：F160601)；CRP试剂盒(艾博抗上海贸易有限公司，批号：GR3184775-11)，VEGF试剂盒(安徽巧伊生物科技有限公司，批号：201807)，EPO试剂盒(AndyGene，批号：AD20180708)，水合氯醛(分析纯，天津市光复精细化工研究所)；Thermo Fisher全波长酶标仪(仪器型号：Multiskan Go，芬兰)，光学显微镜(仪器型号：DM3000 LED，德国)，紫外可见分光光度计(仪器型号：752，中国上海)，微量高速离心机(仪器型号：3-30K；德国)。

1.2 实验动物分组、CMS模型制备及芹菜籽提取物灌胃 将50只SD大鼠随机分为A、B、C、D、E组各10只，其中A、B、C、D组大鼠在CMS模型条件下[在西北地区平时和战时卫勤保障人工试验舱(位于兰州军区新疆乌鲁木齐医院)进行实验，模拟海拔为5 000 m，氧分压为10.84 kP，气压为54.1 kP，温度18～26 ℃，湿度40%～60%。实验过程中每天按时观察大鼠的饮用水、饲料、毛发、粪便、尿液，行为、自主活动、眼、耳、鼻、口有无分泌物以及定时称体质量]喂养30 d，本次制模成模率为100%(PAP>30 mmHg)，制模成功后A组灌胃芹菜籽醇提物270 mg/kg，B组给予芹菜籽水提物270 mg/kg，C组给予硝苯地平片2.7 mg/kg，D组给予纯净水，1次/d，共15 d。剩余10只在平原条件下喂养30 d，后灌胃纯净水，1次/d，共15 d。

1.3 大鼠PAP记录 所有实验大鼠末次给药24 h后腹腔注射10%水合氯醛(2.5 mL/kg)麻醉，固定于实验台，切开颈部及胸部皮肤，于胸骨正中线打开胸腔，暴露肺和心脏，插管由颈外静脉插入，从右侧颈外静脉插管到达右心房，进入右心室，再进入肺动脉，出现PAP波形，针头的另一端和压力换能器连接。将压力变化的数据用生物信号记录仪记录。

1.4 大鼠血清CRP、EPO、VEGF、APO-A1检测 所有实验大鼠完成PAP检测后，腹主动脉采血，室温下静置30 min，以3 000 r/min速度低温离心20 min，保留上清液，采用购买的试剂盒，按照试剂盒说明书采用ELISA法检测CRP、EPO、VEGF、APO-A1，结果以OD值表示。

1.5 大鼠心脏组织形态学观察 所有实验大鼠在腹主动脉采血后处死，实验大鼠心脏组织保持原形条件下切块，用HE染色，中性树胶封固后，采用光学显微镜观察细胞和组织形态结果变化。

2 结果

2.1 各组大鼠PAP比较 A、B、C、D、E组PAP分别为(37.31±0.83)、(31.28±1.39)、(28.37±1.38)、(44.31±2.04)、(20.74±1.10)mmHg，两两比较，P均<0.05。

2.2 各组大鼠血清CRP、EPO、VEGF、Apo-A1水平比较 大鼠血清CRP、EPO、VEGF、Apo-A1水平比较结果见表1。

表1 各组大鼠血清CRP、EPO、VEGF、Apo-A1水平比较

注：与E组比较，*P<0.05；与D组比较，▲P<0.05；与C组比较，#P<0.05；与A组比较，&P<0.05。

2.3 各组大鼠心肌组织形态学比较 A组：低倍镜下可见大鼠心脏组织心肌间质血管明显扩张充血；高倍镜下偶见心肌间质少量嗜酸性病变细胞浸润，胞质呈颗粒样变。B组：低倍镜下可见大鼠心脏组织大鼠心肌部分血管轻微扩张充血，横纹不清；高倍镜下心肌纤维轻微肿胀，心肌间质有少量炎症细胞浸润。C组：低倍镜下可见大鼠心脏组织心外膜较薄，心肌纤维排列轻微程度紊乱；高倍镜下可见少量心肌细胞嗜酸性变性，心肌细胞轻微程度的颗粒样变，部分心肌间质血管轻度扩张和充血，无明显炎细胞浸润。D组：低倍镜下可见大鼠心脏组织心外膜下大量出血，心脏纤维排列紊乱，横纹不清；高倍显微镜下心肌纤维化嗜酸性病变细胞浸润，心肌细胞颗粒样变性，心肌间质血管明显扩张和充血，偶见部分间质血管炎细胞浸润。E组：大鼠心脏组织心外膜下未见明显渗出物附着，未见明显心肌增厚；心肌纤维排列整齐，横纹清晰，未见坏死、变形、肿胀、嗜酸性病变细胞浸润等改变；心肌细胞染色清晰，心肌间质无明显病理改变。

3 讨论

长期受到低大气压及氧分压的影响，会引起多器官组织由于缺氧产生的病变，长时间得不到有效控制可引起高原心脏病、高原性肺水肿、脑水肿等疾病；持续性低压缺氧环境导致肺血管发生重建、肺血管壁增厚、管腔狭窄，从而导致PAP升高，促进右心后负荷增加、右心肥大，最终导致CMS的发生[8]。CMS常表现为红细胞过度增多、血红蛋白水平升高、血细胞比容增加，伴有常见的高原反应症状，胸闷、气短、心悸、头痛，以及脑部功能异常如记忆力减退、失眠等，部分患者伴有血压异常、肺动脉高压，面部、手指出现局部发绀，眼结膜血管扩张。以往CMS治疗方法主要有以下几种，物理方法包括静脉放血疗法、高压氧舱治疗，化学方法包括治疗性单采红细胞术、血液等体积稀释疗法，中药治疗包括党参、红景天、肉苁蓉、人参，西药治疗包括内皮素受体拮抗剂、磷酸二酯酶抑制剂、磷酸二酯酶选择性抑制剂、钙拮抗剂、前列环素、抗凝药、扩血管药物、乙酰唑胺、吸入型一氧化氮等，其治疗原则主要为降低PAP，提高机体携氧量，降低机体需氧量，改善低氧状态，并针对性的治疗并发症。硝苯地平是钙拮抗剂的代表药物，被广泛应用于CMS的治疗，主要用于肺动脉高压的治疗，肺血管收缩是肺动脉高压的主要因素，其机制是在高原缺氧过程中，阻力血管Ca2+通道表达上调，Ca2+浓度升高启动各种核转录因子，使得肺动脉平滑肌细胞增生，肺动脉壁变厚，管腔减小，循环阻力增加，引起肺动脉高压[9]。硝苯地平可通过拮抗Ca2+通道以达到减缓肺动脉高压，缓解CMS症状的目的。但长期服用硝苯地平会导致患者出啊先头晕、恶心、一过性低血压、腹泻、胃痉挛、白细胞减少、紫癜、心肌梗死、充血性心力衰竭、肺水肿心律失常和传导阻滞等。虽然硝苯地平疗效确切，但存在不良反应等缺点。

芹菜籽被少数民族用于治疗高血压脑缺血等疾病，芹菜籽中除了含有营养元素外，还含有多种具有生理学活性的物质，主要包括挥发油化合物、不饱和脂肪酸、黄酮类物质、丁基苯酞类、氨基酸、膳食纤维、香豆素及其衍生物等；其药理作用主要有抗氧化、抗肿瘤、降血脂、降血压等；课题组对芹菜籽分别用乙醇和水进行提取，拟通过不同的提取溶剂分别获得芹菜籽中的脂溶性和水溶性化学成分，以及化学成分的苷与苷原，分别研究其对CMS模型大鼠的作用，以确定其有效成分的作用及其有效的提取方式，为今后进一步研究奠定基础。

PAP升高，促进右心后负荷增加、右心肥大，最终导致CMS的发生。本研究显示，A、B、C组PAP降低，结果提示两种芹菜籽提取物均能通过降低PAP，减低右心室后负荷，延缓右心室肥大心肌重构的发生，且水提物的效果优于醇提物。国外研究表明，高原低氧诱发心肌重构，其组织形态变化主要表现为心脏纤维排列紊乱，横纹不清，纤维化细胞浸润，间质血管明显扩张和充血，炎细胞浸润等[10,11]。本文结果显示，D组大鼠心外膜下大量出血，心脏纤维排列紊乱，横纹不清，心肌纤维化嗜酸性病变细胞浸润，心肌细胞颗粒样变性，心肌间质血管明显扩张和充血，偶见部分间质血管炎细胞浸润；在给予药物干预后，A、B、C组大鼠心脏组织形态发生变化，提示三种药物均能延缓高原低氧诱发的心肌重构。

血清CRP水平可以评估炎症和组织损伤程度，可作为反映心血管疾病的独立危险因素[12,13]。Verma等[14]发现，CRP可以促进内皮细胞活化，加重功能障碍，诱导了细胞凋亡蛋白介导的冠状动脉血管平滑肌凋亡，从而加重心肌不良事件的发生。本研究显示，与D组比较，A、B、C组血清CRP水平均降低，提示三种药物保护了心肌，且减轻了心肌不良事件的发生，醇提物效果最优，水提物次之。EPO与EPO受体(EPOR)结合，促进造血功能，红细胞生成增加后，增加血液的运氧能力，从而改善心肌的缺血、缺氧状态，EPO激活内皮细胞型一氧化氮合酶，诱导一氧化氮合成增加，一氧化氮具有血管扩张功能，增加心肌血液供应，EPO与EPOR结合具有促进新生血管形成的作用，在心肌组织中EPO具有与VEGF相同的促毛细血管生长的作用[15]。本文结果显示，与D组比较，A、B、C组血清EPO水平降低，说明给于药物干预后CMS模型大鼠的心肌缺氧状态得到了明显的改善，芹菜籽醇提物与硝苯地平的效果相近优于芹菜籽水提物。研究[16]证明，VEGF能促进内皮细胞增生，诱发新血管生成。因此，高原缺氧导致的大鼠心肌组织损伤能刺激VEGF分泌，导致新血管生成，呈现心肌纤维增生，心肌间质血管扩张充血等组织形态学变化。本研究显示，与D组比较，A、B、C组血清VEGF值均有不同程度降低，说明药物干预后大鼠心肌纤维增生及心肌间质血管扩张充血得到改善，且芹菜籽两种提取物效果均优于硝苯地平。Apo-A1具有抗炎和抗氧化作用[17]，在炎症反应过程中Apo-A1的水平与IL-1β、IL-6及TNF-α等炎症细胞因子的分泌水平负相关，Apo-A1水平降低进一步导致上述细胞因子的释放失控，最终引发多器官功能障碍综合征[18]。本文结果显示，A、B、C组血清Apo-A1水平升高，说明机体抗炎抗氧化能力明显升高，醇提物效果最优，硝苯地平次之。

总之，芹菜籽两种提取物均具有降低CMS模型大鼠PAP，改善其心肌功能，改善及恢复心肌损伤的作用，对CMS模型大鼠的心脏具有保护作用，血清指标显示醇提物的效果略优于水提物，PAP数据提示水提物降低PAP的效果优于醇提物。通过课题组前期研究及查阅文献，芹菜籽中含有丰富的黄酮类成分[19]，其所含的黄酮类成分具有降压、降脂、抗氧化、调节心血管功能等作用[20]，两种提取物在药效上存在一定差异，主要是其化学成分组成不同，水提物中黄酮苷及水溶性化合物水平较多，醇提物中苷原及高脂溶性化合物水平较高，课题组将进一步研究其化学成分与药理作用的相关性，更好的发掘芹菜籽的药用价值。