基于生物信息分析学方法筛选多发性骨髓瘤差异表达基因

何思羽，王清

(西南医科大学附属医院，四川泸州 646000)

多发性骨髓瘤(MM)是一种起源于浆细胞异常增生的单克隆恶性肿瘤性疾病，常伴有不同程度的骨损害，表现为骨骼破坏、顽固性疼痛、病理性骨折、高钙血症及脊髓受压等，又称之为骨髓瘤骨病(MBD)，是第二常见的血液系统恶性肿瘤[1]。近年来，随着蛋白酶体抑制剂(PIS)、免疫调节药物(IMID)的应用及自体干细胞移植(ASCT)的进行极大改善了MM患者的预后，然而当前仍无法完全治愈，预计2018年在美国MM的死亡可能会达到1 2000人[1，2]。研究[3,4]发现，分子细胞遗传学异常与克隆异质性和克隆进化关系密切，在MM发病中发挥着重要作用。高危细胞遗传学异常患者更容易出现克隆异质性和克隆进化现象，与疾病的发展和预后密切相关，故针对MM的临床和生物学上的异质性，从分子水平探索其治病机制，开发精准治疗方案，进一步改善患者预后，提高生命质量具有重要意义。高通量信息技术的发展为疾病基因改变的研究带来了巨大便利，利用生物信息分析学方法有助于探索分子改变与疾病预后的关系，快速挖掘有效的分子靶标，进一步实现肿瘤精准治疗的研究方向[5，6]。本研究采用生物信息分析学方法从GEO数据库下载并整理有关MM基因微阵列数据，获得肿瘤发生发展过程中显著差异表达基因(DEGs)，从而筛选出可能参与MM发生发展的基因，旨在为探索MM的发病机制、诊断及治疗提供基础。

1 资料与方法

1.1 资料搜集 利用NCBI中基因芯片公共数据库(GEO)芯片数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.go)，以“multiple myeloma，Homo”为关键词搜索目标芯片。经筛选后，采用由Liu等提交以GPL10558 Illumina HumanHT-12 V4.0 expression beadchip为平台的基因芯片GSE113295。该芯片共18例样本，由12例完全缓解MM骨髓样本和6例正常样本构成。

1.2 MM的差异表达基因分析 应用GEO数据库基于R语言中GEOquery[7]和limma[8]程序包的在线分析工具GEO2 R(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)以P<0.05、|logFC|>1.5为条件筛选出GSE113295芯片的差异基因。

1.3 MM的差异表达基因基因功能富集分析及调控通路分析 使用DAVID6.8(The Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery)在线分析工具(https://david.ncifcrf.gov/)以P<0.05为条件筛选出的差异基因进行GO功能注释和KEGG信号通路富集分析。GO是识别并注释高通量基因组或转录组数据的生物学特性的常用分析方法，可按照生物途径分为生物学过程(BP)、分子功能(MF)以及细胞组成(CC)。KEGG通路富集分析则显示差异基因富集的信号通路。

1.4 MM的差异表达基因所调控蛋白互作网络与关键基因分析 使用蛋白互作数据库(STRING，http://string-db.org/)，分析MM骨髓样本和正常样本差异表达基因所编码蛋白的相互作用关系，以互作评分combination score>0.4为条件构建蛋白质互作网络(PPI)。然后将STRING中得到的蛋白互作网络数据导入Cytoscape软件，使用网络分析cytoHubba插件计算网络中节点的点度中心性(DC)、中介中心性(BC)以及接近中心性(CC)，取这3个参数前10名的基因，并取交集。

2 结果

2.1 MM的差异表达基因的筛选结果 按照筛选条件，在GSE113295基因芯片中MM样本和正常样本的差异表达基因共1 380个，其中上调1 274个，下调6个。按照差异倍数|logFC|大小排序，前三个上调基因为羟基17-β脱氢酶13(HSD17B13)、UNC-5家族c-终端(UNC5CL)、GLI家族锌指蛋白1(GLI1)，前三个下调基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG)、MLC成员肌球蛋白调节轻链5(MYL5 )、脂连蛋白(ADIPOQ)。

2.2 MM的差异表达基因GO功能和调控通路分析结果 MM的差异表达基因GO功能在生物学层面上主要介导免疫反应、细胞通讯、细胞黏附、信号转导过程；在细胞组分层面上主要参与细胞质膜组成、整合及胞外间隙的调控；在分子功能层面主要富集于G蛋白偶联受体活性、细胞黏附分子活性、结构因子活性、细胞因子活性。KEGG信号通路分析显示，差异表达基因主要调控神经活性配体—受体相互作用、细胞黏附分子(CAMs)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)信号通路(详见表1)。

表1 在生物学过程、细胞组分、分子功能层面发挥不同功能及调控不同信号通路的差异表达基因

注：基因数量超过20个者只列举20个基因名称。

2.3 MM的差异表达关键基因的筛选结果 以MM差异表达基因构建蛋白质相互作用网络，除去孤立无互作的蛋白节点，筛选出230个具有相互作用关系的蛋白质，构成了包含有507个互作边关系的复杂网络。在复杂的蛋白互作网络中应用cytoHubba插件按照DC、BC以及CC的大小排序，集算出排名前10的中心节点。对这三个参数得出的结果取交集，从而挖掘其中7个关键基因全长重组蛋白(BUB1B)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG)、丝裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)、酪氨酸激酶(FYN)、白介素6(IL-6)、肌醇1，4，5-三磷酸3-激酶B(ITPKB)、zeste同源物2(ZH2)，更有可能参与MM的发生发展，为进一步探索MM的发病机制，发现治疗MM的生物靶点提供基础。

3 讨论

MM是一种无法治愈的恶性克隆性浆细胞肿瘤，有严重的骨痛、病理性骨折、椎体压缩性骨折等骨相关事件，甚至导致患者反复骨折[9]，多发于老年，在并发骨质疏松症的情况下，易被漏诊[10,11]，严重影响患者的生命质量。由此，进一步寻找有助于肿瘤快速诊断和治疗的分子靶标迫在眉睫。在本研究中，我们使用了GEO2R在线工具分析了GEO中的芯片数据GSE113295，包含了12例完全缓解MM样本和6例正常样本，得到了1 380个的差异基因。通过DAVID对DGEs进行GO功能注释和KEGG信号通路分析，发现差异基因主要参与了化学突触传递、ERK 1和ERK 2级联的正调节、酶活性的正调节、钙离子结合、延迟整流钾通道活性等；主要由神经活性配体-受体相互作用、PPAR信号通路、细胞黏附分子、脂肪酸合成等通路介导。本研究结果验证了Saltarella等[12]的结论，血浆水平里与化学突触传递相关的细胞因子和血管生成因子FGF-2、HGF、VEGF和PDGF-β水平对治疗反应有预测意义，有助于描述不同的危险组对治疗结果和疗效的影响；FGF-2与MM的发生发展密切相关[13,14]。钙离子结合信号通路也是介导MM发生的关键病因之一，研究发现非选择性阳离子通道瞬时受体电位香草酸(TRPV2)可通过钙依赖磷酸酶NFAT信号通路调节MM中破骨细胞分化，为MM治疗的策略提供新的思路。ERK 1和ERK 2级联的正调节是肿瘤发生发展中的经典通路之一，研究发现磷酸化细胞外信号调节激酶(ERK1/2)的高表达提示MM预后不良[15]；B-Raf V600E抑制剂Rafoxanide通过增强DNA损伤反应和抑制p38 MAPK通路，引发MM细胞凋亡和细胞周期停滞[16]；敲除活化C激酶1受体基因同样可以通过激活P-P38和P-ERK在MAPK/ERK信号通路减少MM细胞的增殖[17]。

运用蛋白互作数据库STRING以及Cytoscape软件分析DGEs，获得7个关键基因BUB1B、PPARG、MAPK14、FYN、IL6、ITPKB、ZH2。BUB1B基因通过CDC20/CCNB轴促进MM细胞增殖，对于高风险MM患者，可能成为MM治疗的潜在靶点[18]。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG)多态性与MM患者的颌骨唑来膦酸相关性骨坏死(BRONJ)相关[19]；PPARG中SNP的存在可能与早期BRONJ的风险增加有关[20]。IL-6作为破骨细胞分化调节剂，与祖细胞结合时促进破骨细胞生成，过度丰富时又导致过度的破骨细胞活性和骨质溶解，与MM的发生发展密切相关[21]。LYN基因为src家族激酶成员是IL6信号通路的关键介质，可能成为治疗MM的关键靶点[22]。尚未发现肌醇-1，4，5-三磷酸3-激酶-B(ITPKB)、zeste同源物2(ZH2)基因在MM发生发展中有明确的相关性。但是，在结肠癌组织和邻近部分中同样检测到ITPKB的差异表达，并且发现miR-410可通过抑制ITPKB基因表达促进肿瘤细胞增殖并减少细胞凋亡[23]；MicroRNA-31通过下调ZH2基因的表达来触发G2/M细胞周期停滞，增强化学敏感性并抑制人胃癌细胞的迁移和侵袭[24]。为探索MM的发生发展，寻找新的作用靶点提供了新的思路。

总之，利用生物信息分析学方法筛选出MM的关键差异表达基因，一方面通过GO功能注释、KEGG信号通路验证了多个相关实验结果，为今后实验奠定了牢固的理论基础，另一方面筛选出BUB1B、PPARG、MAPK14、FYN、IL6、ITPKB、ZH2共7个关键基因，虽尚不能确定ITPKB、ZH2基因与MM有明确关系，但现有研究结果为MM发病机制研究提供了新的思路，可以为后续临床治疗等方面的研究提供帮助。